棉花纖維初始發(fā)育期14-3-3相互作用蛋白的酵母雙雜交篩選.pdf

1、棉花作為天然纖維的主要來(lái)源，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在世界經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要的作用。隨著紡織工業(yè)的發(fā)展和社會(huì)需求的提高，選育并種植高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的棉花新品種尤為重要。功能基因組學(xué)研究在鑒定大量棉花發(fā)育相關(guān)基因的同時(shí)，初步探索了纖維發(fā)育及其調(diào)控的分子機(jī)制，但是棉花纖維發(fā)育的分子生物學(xué)機(jī)理還遠(yuǎn)未被揭示?；虻墓δ茏罱K都要通過(guò)直接或間接細(xì)胞的信號(hào)或調(diào)控代謝途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，蛋白質(zhì)作為基因的表達(dá)產(chǎn)物又是細(xì)胞主要功能的執(zhí)行者，其表達(dá)、修飾、相互作用的研究是轉(zhuǎn)錄組

2、學(xué)所不能替代的。14-3-3蛋白最初被認(rèn)為是動(dòng)物腦組織所特有的，但是隨著各項(xiàng)研究取得不斷進(jìn)展，大量研究表明該蛋白在真核生物細(xì)胞中普遍存在，目前已知的功能有：調(diào)控植物激素的合成，細(xì)胞分裂，細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)運(yùn)其他蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，調(diào)控代謝酶，離子轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)錄因子的組裝。
　　 本研究所前期研究分析了棉花纖維初始發(fā)育階段李氏無(wú)纖維突變體(Li1)和野生型(WT)胚珠和纖維的蛋白質(zhì)組差異，檢測(cè)并鑒定了兩個(gè)差異表達(dá)的14-3-3蛋白，在此基礎(chǔ)

3、上，本研究采用RACE-PCR方法克隆了這兩個(gè)14-3-3蛋白編碼基因的全長(zhǎng)，酵母雙雜交篩選14-3-3蛋白相互作用的蛋白質(zhì)組，初步探索了棉花纖維初始發(fā)育過(guò)程中14-3-3蛋白可能參與生物學(xué)過(guò)程。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.從棉花中克隆了2個(gè)編碼14-3-3蛋白基因的cDNA，分別命名為Gh14-3-3-E1、Gh14-3-3-E2，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)砌Gh14-3-3-E1為一個(gè)全新的棉花14-3-3蛋白家族基因，Gh14-3-3

4、-E2與Gh14-3-3b只差7個(gè)堿基，有可能是基因突變?cè)斐傻?。這2個(gè)Gh14-3-3基因的編碼蛋白結(jié)構(gòu)高度保守，與其他植物14-3-3蛋白有很高的相似度。
　　 2.將新得到的兩個(gè)14-3-3蛋白基因ORF插入pGBKT7載體，成功構(gòu)建pGBKT7-E1和pGBKT7-E2重組質(zhì)粒。自激活檢測(cè)兩個(gè)誘餌質(zhì)粒均無(wú)自激活現(xiàn)象，經(jīng)毒性檢測(cè)證實(shí)pGBKT7-E1有毒性不宜篩選，而pGBKT7-E2表現(xiàn)正?？捎糜诤Y選酵母cDNA文庫(kù)。

5、r>　　 3.通過(guò)CLONTECH公司的SMART技術(shù)和LD-PCR技術(shù)，以徐州142、徐州142突變體、Li1突變體-3、-1、0dpa的胚珠以及徐州142、Li1突變體的+4、+8dpa纖維為材料，提取RNA逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增ds cDNA。通過(guò)共轉(zhuǎn)化ds cDNA、線性化pGADT7-Rec質(zhì)粒構(gòu)建了一個(gè)棉花多品種纖維初始發(fā)育階段酵母cDNA文庫(kù)，為今后研究棉花纖維初始發(fā)育打下了良好的基礎(chǔ)。
　　 4.通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出