酵母雙雜交系統(tǒng)篩選CTCF相互作用蛋白.pdf

1、背景和目的：基因組印記（Genomic imprinting）是一種配子發(fā)生過程中對某些基因不同親本來源的等位基因進(jìn)行差別標(biāo)記的現(xiàn)象，研究表明基因印記表達(dá)異常是某些惡性腫瘤重要的分子生物學(xué)特征，印記的改變可能是腫瘤發(fā)生中的重要環(huán)節(jié)。CTCF（CCCtc binding factor）是基因組印記調(diào)控中發(fā)揮重要作用的一類蛋白質(zhì)，編碼CTCF的基因定位于16q22，是一類在哺乳動物中廣泛表達(dá)的高度保守的核蛋白，它可以和啟動子，激素反應(yīng)性基因

2、沉默子，隔離子以及基因組印記相關(guān)元件等結(jié)合，在基因后成修飾，細(xì)胞生長和X染色體沉默等過程中有廣泛作用。CTCF 因其在腫瘤中常常發(fā)生功能缺失而被認(rèn)為是一種候選抑癌基因。CTCF作為一個有如此豐富功能的蛋白質(zhì)，不難讓人聯(lián)想到其是一個復(fù)雜的核酸蛋白質(zhì)相互作用體系中重要的一環(huán)，如此多樣的功能的完成也決不是獨(dú)立進(jìn)行的，其必然有眾多的其他元件共同完成這些功能。本室前期研究亦發(fā)現(xiàn)人原發(fā)性肝癌IGF2基因印記異常，同時發(fā)現(xiàn)CTCF在其中具有重要作用，

3、為進(jìn)一步探討CTCF及其相互作用蛋白調(diào)控人肝IGF2基因印記的機(jī)理，以及探討在人肝癌中恢復(fù)IGF2基因的正常的可能途徑，本課題采用酵母雙雜交的方法篩選正常人肝組織中與CTCF有相互作用的蛋白質(zhì)。 方法：CTCF具完整編碼序列的cDNA克隆由美國紐約大學(xué)W.W.Quitschke教授惠贈，經(jīng)對CTCF完整編碼序列的旁側(cè)多克隆位點(diǎn)的適當(dāng)修改，使其與質(zhì)粒載體pGBKT7連接重組為誘餌質(zhì)粒pGBKTj7／CTCF，保持了正確的讀碼框架。

4、通過檢測轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的酵母AHl09在SD／一Trp，SD／一Ade／一Frp，SD／一His／一Trp，SD／一Leu／一Trp固體培養(yǎng)基上的生長情況，判定是否有自激活發(fā)生，并鑒定了重組誘餌蛋白的毒性。以轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的酵母AHl09菌株與人肝cDNA酵母文庫進(jìn)行雜交以篩選有相互作用的酵母克隆，同時進(jìn)行了文庫滴度測定和雜交效率測定。依次在三缺培養(yǎng)基上，四缺培養(yǎng)基上培養(yǎng)和篩選，以及用β－半乳糖苷酶印膜法檢測陽性克隆內(nèi)lacz報告基因的表達(dá)

5、，對雙雜交雜合子進(jìn)行驗(yàn)證和篩選，獲陽性酵母克隆。然后提取陽性酵母克隆質(zhì)粒，采用通用引物PCR擴(kuò)增酵雙雜交陽性酵母克隆中與pGADT7同源重組的人肝cDNA片段，并采用HaeⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行分類分析，將所有陽性克隆酵母質(zhì)粒全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，并提取質(zhì)粒重復(fù)PCR及酶切分析，驗(yàn)證了陽性克隆的正確性，同時減少了克隆的重復(fù)。根據(jù)PCR及酶切分析結(jié)果在70個陽性克隆中選取六個陽性克隆進(jìn)行測序。 結(jié)果：重組穿梭質(zhì)粒pET-28a（

6、+）／CTCF經(jīng)EcoR Ⅰ與Nco Ⅰ酶切鑒定構(gòu)建成功，CTCF讀碼框架正確。重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7／CTCF經(jīng)BamHl和SalI雙酶切及基因測序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功，CTCF讀碼框架正確。誘餌蛋白實(shí)驗(yàn)證實(shí)無自激活作用，對酵母AHl09菌株無毒性。文庫的滴度（5×10<`7>>2×10<,7>）及雜交效率（6％>2％），符合要求，酵母雙雜交后在三缺培養(yǎng)基上共篩選得到400個陽性克隆，在四缺培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)這400個陽性克隆共篩選得到2