酵母雙雜交篩選與A型核纖層蛋白前體相互作用蛋白的初步研究.pdf

1、目的與背景：兒童早老癥(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome，HGPS)是一種非常罕見的遺傳疾病。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：HGPS 是由于LMNA 基因在其外顯子11的第1824位發(fā)生核苷酸替代(C→T)，盡管未造成氨基酸殘基的改變(G608G)，但產(chǎn)生了一個潛在的剪切位點，產(chǎn)生截短50個氨基酸的蛋白所致。Zmpste24 缺失基因(Zmpste24<'-/->)小鼠，導致未加工的A型核纖層蛋白前體(prelam

2、in A)的大量堆積。Zmpste24<'-/->小鼠具有HGPS病人所表現(xiàn)出的很多典型性早衰的現(xiàn)象，我們預測 prelamin A可能通過與其他的相互作用蛋白來引起細胞的早衰，所以欲用酵母雙雜交系統(tǒng)以 prelamin A的C末端為誘餌蛋白篩選出其相互作用蛋白。 方法：通過PCR擴增pTracer-CMV-PLA 質(zhì)粒獲得A型核纖層蛋白前體的C末端cDNA(1165～1995bp)，將NdeⅠ+EcoR Ⅰ雙酶切的PCR產(chǎn)物連

3、接同樣雙酶切的載體pGBKT7構(gòu)建成pGBKT7-PLA-C質(zhì)粒(BD誘餌質(zhì)粒)。將pGBKT7-PLA-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)到酵母 AH109中，觀察到prelamin A的C末端對酵母AH109 毒性，檢測prelamin A 的 C末端對報告基因的自主激活活性。將構(gòu)建于pACT2質(zhì)粒(酵母雙雜交中的AD質(zhì)粒)的人骨骼肌細胞cDNA 文庫酵母菌Y187與含成功構(gòu)建的BD 質(zhì)粒的酵母菌AH109雜交融合后得到初篩候選陽性克隆，從這些候選克隆中，通

4、過轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得單一文庫質(zhì)粒，再進行自主激活報告基因檢測和一對一回復性雜交實驗，最后篩選出真陽性克隆(即與人A型核纖層蛋白前體蛋白相互作用的蛋白)。經(jīng)上述一對一回復確證為陽性相互作用的AD質(zhì)粒，以pACT2質(zhì)粒的通用引物為測序引物測定該質(zhì)粒的插入片段cDNA序列。通過國際互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以美國國立生物信息中心(NCBI)的BLAST作為主要的檢索工具，檢索主要程序采用BLAST，對相互作用蛋白的cDNA 序列進行同源性分析，最終確

5、定該相互作用蛋白的名稱。 結(jié)果：成功構(gòu)建pGBKT7-PLA-C 穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建誘餌酵母株 AH109[pGBKT7-PLA-C]，證實prelamin A的C末端對酵母AH109沒有毒性和報告基因自主激活活性。經(jīng)酵母雙雜交實驗，篩選出七種與prelaminA的C末段相互作用蛋白，核酸序列分析及同源性檢索結(jié)果為：①人triadin蛋白；②人慢型肌球蛋白結(jié)合蛋白C；③人分選、裝配結(jié)構(gòu)元件；④金屬硫蛋白2A；⑤環(huán)指蛋白1；⑥亞甲基四