應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選RTN4-C相互作用的蛋白.pdf

1、RTNs家族是一類發(fā)現(xiàn)比較晚并且功能也不清楚但有著特異拓撲結(jié)構(gòu)的蛋白家族，該家族成員在生物體內(nèi)有著較廣泛的表達。RTNs主要存在于高等脊椎動物中，其成員都含有兩個較大的跨膜區(qū)并且在蛋白的C端有一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(KDEL)。這些同源區(qū)大約含跨度200個氨基酸，因為該序列在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白中很保守，因此這些序列又稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白同源區(qū)(RHD)。 在人和鼠中發(fā)現(xiàn)至少有4個RTN基因的存在(RTN1， RTN2， RTN3， RTN4)。

2、其中RTN4因近些年來發(fā)現(xiàn)它能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后神經(jīng)元軸突的再生，因此又稱為Nogo(neurite outgrowth inhibitor protein)。 過表達RTNs家族的RTN3能夠阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間蛋白的轉(zhuǎn)運，并且能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過載反應(yīng)，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的耗竭，引起細胞發(fā)生凋亡。 本文研究的RTN4-C (Nogo-C)是RTN4基因編碼的一個最小的蛋白。我們先前的工作表明過表達RTN

3、4-C能夠抑制肝癌細胞株SMMC7721的生長并促進該細胞發(fā)生調(diào)亡。為了進一步研究該蛋白的功能，本文運用酵母雙雜交技術(shù)等研究 RTN4-C相互作用的蛋白，初步探討RTN4-C促進細胞凋亡的機制。 1．運用酵母雙雜交篩選到RTN4-C相互作用的蛋白RTN3本研究以胎鼠的RIN4-C蛋白的全長為誘餌蛋白篩選小鼠7天的胚胎文庫，經(jīng)過回復(fù)驗證，測序分析共得到3個陽性克隆，分別是RIREN2310016E02， RTN3，Gpihbpl

4、。蛋白相互作用的定量分析表明RIREN2310016E02與RTN4-C作用最強，RTN3次之，Gpihbpl最弱。但是由于RIREN2310016E02的功能還沒有報道， Gpihbpl的功能也不明確，且與RTN4-C相互作用較弱，所以本文選擇RTN3進一步研究。 2．RTN4-C和RTN3相互作用的進一步確定本研究用免疫共沉淀技術(shù)驗證RTN4-C和RTN3之間的相互作用。將 RTN4-C和RTN3分別與：Myc和HA蛋白標

5、簽融合，在HEK293細胞中過表達這兩種融合蛋白。首先以Myc抗體進行免疫共沉淀，在沉淀復(fù)合物中用HA抗體進行免疫印跡，檢測是否有RTN3融合蛋白，其次以HA抗體進行免疫沉淀，在沉淀復(fù)合物中用Myc抗體進行免疫印跡，檢測是否有RTN4-C融合蛋白，結(jié)果表明RTN4-C和RTN3能夠在細胞內(nèi)發(fā)生相互作用。 3．RTN4-C和RTN3在細胞內(nèi)共分布相互作用的蛋白一般在細胞內(nèi)有著共同的分布，本文同樣也研究了RTN4-C和RTN3在細

6、胞內(nèi)的分布。首先以免疫熒光技術(shù)顯示RTN4-C和RTN3過表達在 HEK293細胞中共分布，其次將RTN4-C和RTN3分別和綠色和紅色熒光蛋白融合，直接在熒光顯微鏡下觀察到兩者在Hela細胞中共分布。 4．RTN4-C通過其疏水區(qū)與RTN3相互作用為了進一步明確RTN4-C是通過其自身的哪個結(jié)構(gòu)域與RTN3相互作用，本文構(gòu)建RTN4-C不同的缺失突變體，分別與RTN3進行免疫共沉淀，結(jié)果表明 RTN4-C通過其疏水區(qū)與RTN

7、3相互作用的。進一步分析了RTN4-C缺失突變體在細胞內(nèi)的分布，結(jié)果表明該蛋白的疏水區(qū)在其細胞的亞定位中起重要作用。 5．RTN4-C和RTN3的相互作用抑制它們促進細胞凋亡的能力在HEK293細胞中過表達RTN4-C和/或RTN3，運用流式細胞檢測技術(shù)分析表明，RTN4-C和RTN3在細胞內(nèi)共表達時細胞發(fā)生凋亡的比例較：RTN4-C和RTN3單獨在細胞內(nèi)過表達時低。 總的來說，本文通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到RTN4-