應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選直藻MBP相互作用蛋白.pdf

1、目的：自從MAR(Matrix Attachment Region)片段分離以來，有關(guān)MAR及其功能的研究一直是分子生物學(xué)的熱點(diǎn)之一。目前已知MAR具有提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平等作用，但MAR的作用機(jī)制尚不清楚。MAR作為順式作用元件，其作用是和其結(jié)合蛋白有關(guān)的。但目前對MAR結(jié)合蛋白的研究較少，只有少部分MAR結(jié)合蛋白被分離出來。前期研究中，已從真核單細(xì)胞杜氏鹽藻中篩選出一個(gè)MAR結(jié)合蛋白(MAR-binding protein，MBP)，

2、該蛋白基因全長1623bp，原核表達(dá)及其功能研究證實(shí)該蛋白能與MAR結(jié)合，蛋白定位于細(xì)胞核。本研究中，擬通過構(gòu)建“誘餌”載體pGBKT-MBP，進(jìn)而利用酵母雙雜交從杜氏鹽藻cDNA文庫篩選與MBP相互作用的蛋白，探討MBP基因的性質(zhì)及生物學(xué)意義。
　　 方法：提取杜氏鹽藻總RNA，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫MBP基因序列，設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增MBP基因全長。將擴(kuò)增的MBP基因依次插入pMD18-T及pGBKT-7載體，構(gòu)建酵

3、母雙雜交誘餌載體。將經(jīng)過酶切、測序鑒定正確的pGBKT-MBP載體轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，檢測誘餌載體毒性及自激活。將通過檢測的Y187菌株(轉(zhuǎn)化有“誘餌”質(zhì)粒)與AH109菌株(含有文庫質(zhì)粒)進(jìn)行雜交融合，在缺陷性平板篩選克隆，并通過MEL1基因顯色反應(yīng)來鑒別陽性克隆。提取酵母陽性克隆文庫質(zhì)粒，與誘餌質(zhì)粒進(jìn)行一對一回復(fù)性雜交，再次確認(rèn)陽性克隆，并對克隆進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)果：利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出1623bp片

4、段，將該片段插入pMD18-T及pGBKT-7載體，經(jīng)酶切、測序分析該片段為MBP基因全長。pGBKT-MBP載體轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，僅在SD/-Trp平板生長，且為白色菌落，而在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade平板均不生長，表明“誘餌”質(zhì)粒無自激活。單菌落過夜搖菌后OD600值大于0.8，表明“誘餌”質(zhì)粒對酵母菌株無毒性。經(jīng)過篩選杜氏鹽藻cDNA文庫，初步篩選出26個(gè)克隆，經(jīng)過多次X-α-Gal平板篩選，最終確定7