一個(gè)FALS突變SOD1相互作用蛋白篩選及鑒定.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文一個(gè)FALS突變SOD1相互作用蛋白篩選及鑒定姓名：陳桂生申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：李露斯20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文上述4種氨基酸營養(yǎng)的培養(yǎng)板上生長。而且MELl基因表達(dá)的半乳苷酶為分泌型蛋白。可以在固相培養(yǎng)基中直接與X一0【一gal底物相互作用，顯示為藍(lán)色，相對(duì)于檢測(cè)p半乳糖苷酶來說操作得到了極大的簡化。該系統(tǒng)由于增加了報(bào)告基因的種類，使篩選結(jié)果陽性率達(dá)到95％。雖然酵母雙雜交系統(tǒng)

2、已成為生物學(xué)家研究蛋白相互作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，但不能排除由于酵母生物本身特征而產(chǎn)生的非真實(shí)相互作用。所以在用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行文庫篩選之后，通過多種方法進(jìn)行驗(yàn)證。如利用免疫共沉淀技術(shù)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步確定相互作用的存在。我科于1999年在重慶市潼南縣發(fā)現(xiàn)的一個(gè)ALS家系具有與目前文獻(xiàn)報(bào)道完全相同的臨床表型。我們應(yīng)用參數(shù)連鎖分析的方法對(duì)該家系進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)該家系致病相關(guān)基因與位于21號(hào)染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記D21S223位點(diǎn)相連鎖。SO

3、Dl是位于2l號(hào)染色體上D21s223位點(diǎn)附近唯一的特征性基因，因此我們推測(cè)，該家系發(fā)病的原因可能是由SODl基因突變引起的，同時(shí)可能存在新的SODl突變類型。我們采用聚合酶鏈單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(p01ymerasechainreactionsingle—straJldconformationpolymorphism，PCR—SScP)法對(duì)該ALS家系SODl基因進(jìn)行了突變分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家系部分成員SODl基因2號(hào)外顯子編碼區(qū)和5號(hào)

4、外顯子非編碼區(qū)發(fā)生了插入突變，這可能是新的SODl基因突變類型，其中2號(hào)外顯子的突變可能為該家系發(fā)病的原因。但是該突變的SODl基因功能和編碼蛋白質(zhì)的作用還不清楚。蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者和執(zhí)行者，直接對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式進(jìn)行研究就成為生命科學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)。通常要對(duì)一個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行深刻的了解，就必須得到下面幾方面的信息：(1)哪一個(gè)區(qū)域是該蛋白質(zhì)進(jìn)化上的保守結(jié)構(gòu)域；(2)該蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；(3)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布；(4)翻

5、譯后的修飾和加工；(5)哪些蛋白質(zhì)與該蛋白質(zhì)存在相互作用。鑒定一個(gè)新蛋白質(zhì)的功能時(shí)，一個(gè)重要的方面是鑒定與其相互作用的蛋白質(zhì)。文獻(xiàn)檢索，目前未見與mSODl相互作用蛋白的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用Clontech公司的MATCHMAK—ER酵母雙雜交系統(tǒng)3篩選與mSODl相互作用的蛋白，以揭示mSODl的功能。目的(1)確定該mSODl是否為新的SODl突變基因；尋找mSODl的同源基因；明確mSoDlcDNA序列保守性和相似性，以確定mso