PINK1蛋白相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、帕金森病（Parkinson'sdisease，PD）是一種常見(jiàn)于老年人的神經(jīng)退行性疾病。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是眾多研究顯示，線粒體功能障礙在PD發(fā)病機(jī)制中起了重要作用：線粒體毒素（如MPTP）可以在人類或動(dòng)物模型引起PD樣表現(xiàn)；PD患者的線粒體功能障礙常見(jiàn)；PD致病基因之一的編碼產(chǎn)物PINK1蛋白在線粒體上發(fā)揮其生物學(xué)功能。 研究顯示，PINK1蛋白定位于線粒體，對(duì)線粒體具有保護(hù)功能。了解PINK1蛋白的功能對(duì)于理解PD

2、的發(fā)病機(jī)制以及治療具有重要意義。雖然已經(jīng)對(duì)PINK1蛋白的功能進(jìn)行了許多研究，目前對(duì)其如何發(fā)揮保護(hù)線粒體功能并不清楚。許多蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用參與生物學(xué)過(guò)程而發(fā)揮其功能，因此尋找PINK1蛋白的相互作用蛋白是理解PINK1蛋白功能的一個(gè)重要途徑。為了尋找可能與PINK1蛋白存在相互作用的蛋白，我們從如下5個(gè)方面進(jìn)行了研究： 1.首先應(yīng)用基因重組技術(shù)，以本研究小組前期工作中構(gòu)建的pcDNA3.1-PINK1為模板，成功構(gòu)建了野生型P

3、INK1蛋白酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-PINK1。經(jīng)測(cè)序證實(shí)PINK1基因閱讀框正確，載體構(gòu)建正確。然后將pGBKT7-PINK1轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，應(yīng)用Westernblot技術(shù)，檢測(cè)PINK1蛋白在酵母菌株AH109中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PINK1蛋白能夠在酵母菌株AH109中正確表達(dá)。 2.將27μlMATCHMAKER Human Fetal Brain GAL4 cDNA&genomic libraries原始

4、菌液鋪到300個(gè)150mm皿中，在30℃溫箱中培養(yǎng)24-36小時(shí)至菌落融合，刮取菌落，共收集菌液1000ml。使用QIAGENTip2500試劑盒抽提1000ml菌液的cDNA質(zhì)粒，共獲得2.593mg文庫(kù)cDNA質(zhì)粒。 3.采用大規(guī)模酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)，將所抽提的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞AH109/pGBKT7-PINK1，進(jìn)行人胎腦cDNA文庫(kù)篩選。按照文庫(kù)說(shuō)明書(shū)要求，共進(jìn)行了4次文庫(kù)篩選，共篩選了6.65×106個(gè)克隆

5、，篩選得到77個(gè)His+克隆，繼續(xù)進(jìn)行Ade+/Mell+表型檢測(cè)，我們總共獲得了61個(gè)Ade+/His+/Mell+克隆。 4.61個(gè)Ade+/His+/Mell+克隆經(jīng)過(guò)劃線、PCR及酶譜分析消除重復(fù)克隆，我們獲得了49個(gè)Ade+/His+/Mell+克隆。通過(guò)自激活驗(yàn)證消除能夠自激活的克隆，最終我們篩選獲得了2個(gè)真陽(yáng)性克隆。經(jīng)過(guò)測(cè)序和在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST，這兩個(gè)真陽(yáng)性克隆都是已知的蛋白質(zhì)，它們是KIF1A（ki

6、nesinfamilymember1A）和BAG5（BCL2-associatedathanogene5）。這說(shuō)明PINK1蛋白可能與KIF1A和BAG5分別存在相互作用。 5.由于我們獲得的KIF1A序列位于其mRNA的不翻譯區(qū)，因此認(rèn)為KIF1A不能作為PINK1蛋白互作蛋白的候選蛋白。而我們篩選到的BAG5序列位于其氨基端編碼區(qū)，故繼續(xù)進(jìn)行了BAG5與PINK1蛋白是否存在互作的驗(yàn)證。收集HEK293A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的HA-

7、PINK1蛋白，與JM109表達(dá)的GST-BAG5相孵育，在G4B（Glutathione4B）勻漿中進(jìn)行pulldown結(jié)合實(shí)驗(yàn)，Westernblot中應(yīng)用抗HA抗體作免疫印跡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Input及HA-PINK1+GST-BAG5中均見(jiàn)一條63kDa大小的全長(zhǎng)型和一條52kDa大小的成熟型PINK1條帶；將PKH3-HA-PINK1和pEGFP-N3-BAG5質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，用抗GFP抗體免疫沉淀BAG5蛋白，分別

8、用抗HA抗體和抗GFP抗體做免疫印跡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在經(jīng)抗GFP抗體沉淀的蛋白復(fù)合物中檢測(cè)到GFP和GFP-BAG5蛋白，說(shuō)明免疫沉淀成功；用抗HA抗體做免疫印跡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中存在一條63kDa大小的全長(zhǎng)型PINK1條帶及一條52kDa大小的成熟型PINK1條帶。這些結(jié)果說(shuō)明PINK1蛋白與BAG5在細(xì)胞體內(nèi)、外均存在相互作用。繼續(xù)進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)PINK1蛋白與BAG5之間的相互作用是直接相互作用。 我們首次采用酵母雙