稻瘟菌激活蛋白PemG1的互作蛋白篩選及功能分析.pdf

1、稻瘟菌激活蛋白PemG1是從稻瘟菌(Magnaporthe griesea)中分離的一種蛋白激發(fā)子，具有誘導(dǎo)植物抗病、促進(jìn)植物生長的活性。目前，激活蛋白在植物體內(nèi)的受體蛋白和信號傳導(dǎo)途徑成為研究的熱點(diǎn)。本文利用酵母雙雜交系統(tǒng)和噬菌體展示技術(shù)篩選PemG1的互作蛋白和活性多肽，并對互作蛋白進(jìn)行受體特征分析，主要研究結(jié)果如下： 1.酵母雙雜交LexA系統(tǒng)篩選：將稻瘟菌激活蛋白基因pemG1克隆到誘餌質(zhì)粒載體pLexA上，構(gòu)建DNA-

2、BD融合載體pLexA-pemG1表達(dá)誘餌蛋白，將該重組誘餌質(zhì)粒pLxA-pemG1轉(zhuǎn)入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中發(fā)現(xiàn)無自激活報(bào)告基因作用，對酵母細(xì)胞也無毒性。進(jìn)一步順序轉(zhuǎn)化，篩選克隆在pB42AD載體上的番茄cDNA文庫，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SD/Raf/Gal/-His/-Trp/-Leu/-Ura/X-Gal+Busalts)進(jìn)行互作蛋白的篩選，排除假陽性，最終獲得了十組互作蛋白，對這些互作蛋白進(jìn)行NCBIBLAST比

3、對，分析推導(dǎo)出互作蛋白MGIP-18具有二次跨膜的結(jié)構(gòu)特征，我們認(rèn)為它可能是PemG1的蛋白受體。 2.酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)篩選：將基因pemG1克隆到誘餌質(zhì)粒載體pGBKT7上構(gòu)建DNA-BD融合載體pGBKT7-pemG1，轉(zhuǎn)化酵母AH109，檢測無自激活作用和細(xì)胞毒性。利用SMARTTMcDNA合成技術(shù)，首先用Tri-zol提取水稻總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄PCR和長距離PCR制備含有同源重組位點(diǎn)SMARTⅢ和CDSⅢ序列的水

4、稻dscDNA；共轉(zhuǎn)化重組誘餌載體pGBKT7-pemG1、SmaI線性化的文庫載體pGADT7-Rec和SMARTTM技術(shù)合成的dscDNA，在四缺培養(yǎng)基(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)上，篩選得到互作蛋白MGIP4-1(或MGIP4-6)，它與熱激蛋白DnaJ高度同源。熱激蛋白DnaJ作為分子伴侶參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊等過程，并且調(diào)節(jié)受體與配體的結(jié)合。 3.噬菌體展示技術(shù)淘洗：利用純化的P

5、emG1蛋白作為抗原包被免疫管，再用噬菌體十五肽庫親和吸附，經(jīng)過低PH溶液洗脫并進(jìn)行噬菌體的擴(kuò)繁。四輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集淘洗后，隨機(jī)挑選90個(gè)克隆，進(jìn)行ELISA反應(yīng)，測定OD450的吸光值，挑選陽性克隆并測序，比對分析得到了線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈上的NADH脫氫酶的兩個(gè)亞基多肽序列B2，C2(或D2)，以及DnaJ族熱激蛋白的J結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)序列D3(或E2)。 4.結(jié)構(gòu)功能分析：作為受體蛋白，通常與配體分子結(jié)合，具有