ZmCIPK8互作蛋白CBLs的篩選.pdf

1、CBL(calcineurin B-like proteins)是近年來發(fā)現(xiàn)的植物所特有的一類鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白，與其靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)一起在植物應(yīng)答脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。前期研究表明ZmCIPK8在玉米逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，探究它與CBLs的互作關(guān)系對于進(jìn)一步研究ZmCIPK8響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制具有重要意義。本研究采用生物信息學(xué)、酵母雙雜交、RT-PCR及

2、亞細(xì)胞定位等技術(shù)，初步篩選分析了可能與ZmCIPK8相互作用的的CBLs，主要結(jié)果如下:
　　(1)通過與水稻和擬南芥中的CBL基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，篩選得到10個玉米CBL基因序列。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)玉米的CBL分為3個類群，CBL4、CBL5、CBL8分為1個類群，CBL10單獨為1類群，其余分為另外1個類群。蛋白結(jié)構(gòu)位點分析發(fā)現(xiàn)10個CBL均含有3個EF-hand結(jié)構(gòu)域，并且每個EF-hand手型結(jié)構(gòu)域的大小完

3、全一致，結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)域大小也是相同的情況，只有首尾兩端的序列大小存在差異。CBL1、CBL9具有很高的同源性(99％)，處于同一個進(jìn)化分枝，并具有完全一致的EF-hand結(jié)構(gòu)域，推測它們可能具有共同的靶蛋白。
　　(2)在酵母雙雜交系統(tǒng)中，以PGBKT7-ZmCIPK8作為誘餌載體，從10個玉米CBL中篩選可以與ZmCIPK8互作的CBLs蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有PGADT7-CBL1、PGADT7-CBL4、PGADT7-CBL

4、9質(zhì)粒的3個轉(zhuǎn)化組在四缺板有菌落生長，X-gal染色實驗也發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的菌落可以在8h之內(nèi)顯藍(lán)色。推測CBL1、CBL4、CBL9與ZmCIPK8之間可能存在相互作用。它們的基因登陸號分別為EU907931、EU973091、EU960527。
　　(3)為了進(jìn)一步驗證ZmCIPK8與CBL1、CBL4、CBL9在植物體內(nèi)是否存在相互作用，我們進(jìn)一步分析了玉米中這4個基因在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。ZmCIPK8基因在根與葉中的表達(dá)情

5、況相似，都是在30 min時段表達(dá)量稍微升高，之后逐漸降低。CBL1、CBL4、CBL9基因在脅迫初期的表達(dá)量都是有所升高，然后逐漸降低，這為它們可能在植物體內(nèi)的相互作用提供了依據(jù)。
　　(4)為了明確CBL1、CBL4、CBL9在亞細(xì)胞中的定位情況，構(gòu)建了CBL1、CBL4、CBL9基因與eGFP的PS1300融合表達(dá)載體。使用農(nóng)桿菌EH105做介導(dǎo)，通過瞬時表達(dá)技術(shù)侵染洋蔥表皮細(xì)胞，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CBL1、CBL4、CB