柑橘NAC036互作蛋白的篩選與驗(yàn)證.pdf

1、我國(guó)作為柑橘的重要原產(chǎn)地，擁有數(shù)目繁多、品質(zhì)優(yōu)良的地方特色品種?！扒喈T柑”是2000年在浙江溫州市甌海區(qū)發(fā)現(xiàn)的普通甌柑的芽變，因成熟時(shí)果皮仍為綠色而得名，是一個(gè)典型的成熟衰老延緩型突變材料?！扒喈T柑”的出現(xiàn)，為研究柑橘果實(shí)的成熟和衰老提供了珍貴的實(shí)驗(yàn)材料。
　　NAC(NAM、ATAF1/2、CUC1/2)轉(zhuǎn)錄因子家族不僅成員眾多，而且廣泛存在于陸生植物中，參與調(diào)控植物生命活動(dòng)中的許多生物學(xué)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)以青甌柑為材料，克隆NAC轉(zhuǎn)

2、錄因子家族成員NAC036，運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)及雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)篩選互作蛋白，并初步預(yù)測(cè)NAC036的功能，探究其與青甌柑表型形成之間的關(guān)系，以期揭示NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控青甌柑果實(shí)成熟及采后衰老的機(jī)制。研究結(jié)果如下:
　　1.以花后210 d的青甌柑果實(shí)黃皮層cDNA為模板，PCR擴(kuò)增NAC036全長(zhǎng)及短截ORF片段，構(gòu)建PGBKT7誘餌載體，自激活及毒性測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，各誘餌載體在AH109和Y187型酵母菌株中均不存在自激活活性，

3、但對(duì)兩種菌株都存在不同程度的毒性作用從而影響酵母生長(zhǎng)。
　　2.利用Mating法篩選酵母雙雜交文庫(kù)，經(jīng)二次營(yíng)養(yǎng)壓力篩選和測(cè)序，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后獲得10個(gè)候選的與NAC036互作的轉(zhuǎn)錄因子，分別為AP2、ZFN、BIM2、GTE6、NAC72、NAC78、TCP13、NAC2、NAC1和NAC29。其中大多是NAC家族成員，且基因注釋表明這些NAC成員與逆境脅迫及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。
　　3.點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證互作的準(zhǔn)確性，除NA

4、C29與誘餌載體共轉(zhuǎn)化酵母未見(jiàn)藍(lán)斑外，其余組合均顯藍(lán)色。推測(cè)NAC29和NAC036的互作可能為假陽(yáng)性，其余9個(gè)候選蛋白與NAC036存在互作的可能，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4.雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，YFP的N端為NAC036-PCL112融合載體，YFP的C端為候選基因-PCL113融合載體，分別轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，將混合菌液注射本氏煙草，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光，結(jié)果顯示:NAC2、NAC1、NAC29與NAC036的組合

5、在YFP激發(fā)光波段內(nèi)均未檢測(cè)到熒光信號(hào)，推測(cè)其與NAC036的互作為假陽(yáng)性，而AP2、ZFN、BIM2、GTE6、NAC72、NAC78、TCP13與NAC036的組合在激發(fā)光波段內(nèi)，細(xì)胞核均產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，推測(cè)它們與NAC036可能存在相互作用。
　　5.結(jié)合酵母雙雜交系統(tǒng)與雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測(cè):NAC2、NAC1、NAC29與NAC036的互作為假陽(yáng)性，AP2、ZFN、BIM2、GTE6、NAC72、NAC78、TCP