耐輻射奇球菌Dps-2蛋白的互作蛋白篩選.pdf

1、背景及目的：耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是目前世界上已知最強(qiáng)的抗輻射生物之一，以其對于電離輻射等諸多逆境因素的超強(qiáng)耐受和抵抗力而著稱，其抗性機(jī)理主要可歸因于其特殊的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和生存方式、對DNA損傷的精確高效修復(fù)以及卓有成效的抗氧化體系。Dps(DNA protection during starvation)蛋白是DR菌抗氧化體系的重要成分。在DR菌內(nèi)有兩種Dps蛋白，分別由DR2263和DRB0

2、092基因編碼；由于大多數(shù)細(xì)菌只表達(dá)一個Dps蛋白，而且DR內(nèi)的兩種Dps蛋白在序列同源性及基因來源等生物信息學(xué)比較上存在差異，推測Dps蛋白在DR內(nèi)行使的功能及作用途徑會與其它種屬不同，這種種屬間的差異對于解釋DR菌超強(qiáng)抗性的機(jī)制可能具有重要意義。本研究以編碼Dps-2的DRB0092(dps)基因作為研究對象，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-dps，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與Dps-2蛋白有相互作用的蛋白質(zhì)，以期了解Dps-2蛋白

3、可能與哪些蛋白質(zhì)因子相互作用共同完成抗氧化功能。這將有助于明確DR菌高效抗氧化系統(tǒng)的分子機(jī)制，為DR菌輻射抗性的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供新的資料。
　　方法：利用基因工程方法構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-dps，經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，將pGBKT7-dps/pGADT7轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109中，觀察其是否影響酵母宿主菌的生長以及是否具有自身相互作用、自激活性質(zhì)；在本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的兩種DR菌基因組文庫(pGADT7–DNADR/Sau3AI

4、和 pGADT7–DNADR/HpaⅡ)基礎(chǔ)上，通過酵母雙雜交技術(shù)從DR菌基因組表達(dá)文庫中篩選可能與Dps-2相互作用的蛋白。
　　結(jié)果：誘餌載體pGBKT7-dps構(gòu)建成功，通過檢測發(fā)現(xiàn)其對酵母宿主菌無毒性，該載體無自激活活性，但可發(fā)生自身相互作用；利用酵母雙雜交篩選可與Dps-2蛋白發(fā)生相互作用的7個藍(lán)色陽性克隆。
　　結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了酵母雙雜交系統(tǒng)釣餌質(zhì)粒 pGBKT7-dps，該質(zhì)粒對于酵母菌株AH109無