GhHAP5的表達(dá)分析及其互作蛋白的篩選鑒定.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum)是錦葵科棉屬植物，原產(chǎn)于亞熱帶。棉花是世界上最主要的農(nóng)作物之一，世界上主要產(chǎn)棉國(guó)有中國(guó)、美國(guó)、印度等。目前關(guān)于棉花生長(zhǎng)發(fā)育，特別是棉纖維發(fā)育的分子機(jī)制研究，雖然已有一些報(bào)道，但仍十分不清楚，有待深入探討。
　　 CCAAT框是真核生物中普遍存在的一類上游啟動(dòng)元件和一些基因的增強(qiáng)子，它對(duì)于植物組織形態(tài)的建成起著非常重要的作用。其中HAP復(fù)合體就是與CCAAT結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，也稱為NF-Y

2、。HAP復(fù)合體包括3個(gè)亞基，分別是HAP2(NF-Y；CBF-B)，HAP3(NF-YB；CBF-A)，and HAP5(NF-YC；CBF-C)。本實(shí)驗(yàn)從棉花cDNA文庫中分離了一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，GhHAP5。該cDNA全長(zhǎng)1232bp，包含777bp的開放閱讀框，共編碼258個(gè)氨基酸。本文對(duì)GhHAP5及其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、定位進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并對(duì)GhHAP5的互作蛋白進(jìn)行了篩選鑒定。取得了如下研究結(jié)果：
　　

3、 1.GhHAP5的基因及其蛋白結(jié)構(gòu)分析。
　　 通過PCR的方法從棉花基因組DNA(gDNA)中分離了GhHAP5的DNA全長(zhǎng)序列，通過與其cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)GhHAP5基因序列與其cDNA序列相同，這表明GhHAP5基因中沒有內(nèi)含子。該基因所編碼的GhHAP5蛋白含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(第81-204氨基酸)，屬于H2A亞家族。該蛋白還含有一個(gè)核定位序列(RRTLQKN)。
　　 2.GhHAP5基因在棉花纖維中優(yōu)勢(shì)表

4、達(dá)，并且受棉纖維發(fā)育的調(diào)控。
　　 組織表達(dá)分析顯示，GhHAP5基因在開花10天后的棉纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在葉片和下胚軸中表達(dá)量也較高，而在其他組織中表達(dá)量很低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示GhHAP5基因在棉纖維發(fā)育不同時(shí)期其表達(dá)量有所不同。在纖維發(fā)育的早期，GhHAP5基因有一個(gè)較高的表達(dá)水平，在開花10天后的棉花纖維中表達(dá)量最高，其后，隨著纖維細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育而逐漸下降。
　　 3.GhHAP5的亞細(xì)胞定位。
　　 構(gòu)建了

5、GhHAP5：eGFP融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥幼根，發(fā)現(xiàn)綠色熒光定位在細(xì)胞核中，這證明GhHAP5蛋白定位在細(xì)胞核中。
　　 4.GhHAP5蛋白的轉(zhuǎn)錄自激活分析。
　　 利用酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證了GhHAP5蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。構(gòu)建了pGBKT7-GhHAP5載體，將其轉(zhuǎn)化到Y(jié)187的酵母菌株。通過劃線和顯色分析發(fā)現(xiàn)，GhHAP5蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，表明它

6、可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子。
　　 5.GhHAP5的相互作用蛋白篩選鑒定。
　　 通過酵母雙雜交技術(shù)篩查棉纖維cDNA文庫，獲得了一些能夠與GhHAP5蛋白相互作用的蛋白，主要分為以下幾類：NF-YB(即HAP3)轉(zhuǎn)錄因子、MYB109轉(zhuǎn)錄因子、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖基水解酶和WD重復(fù)蛋白等。這為進(jìn)一步分析該蛋白的功能及其調(diào)控提供了基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室之前從棉花中分離了多個(gè)GhBCP基因并對(duì)其進(jìn)行了初步研究，本文對(duì)其表達(dá)及

7、功能進(jìn)行了進(jìn)一步分析。
　　 6.重金屬離子調(diào)節(jié)GhBCP基因在棉花纖維中的表達(dá)。
　　 為了研究在棉花纖維中重金屬離子(Cu2+，Zn2+，Al3+)對(duì)GhBCP表達(dá)水平的影響，我們分別用不同濃度的重金屬離子來處理棉花10DPA的纖維3h后進(jìn)一步檢測(cè)了4個(gè)藍(lán)銅蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)我們用不同濃度的CuSO4和ZnSO4來處理時(shí)，GhBCP1/2/3/4基因的表達(dá)水平呈上升的趨勢(shì)。但是當(dāng)我們用Al2(SO4)3處理后這些基因