RSV-SP蛋白與擬南芥互作因子的篩選與鑒定.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)屬于纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus），曾多次在我國(guó)不同地區(qū)大量發(fā)生，由該病引起的水稻條紋葉枯病給我國(guó)水稻生產(chǎn)產(chǎn)生了巨大的影響。RSV由4條單鏈RNA組成，其中RNA4區(qū)段編碼病害特異性蛋白(disease-specificprotein，SP)。在RSV的病理學(xué)、分子生物學(xué)等方面已經(jīng)做了大量研究，發(fā)現(xiàn)SP蛋白在感病葉片中的積累量愈多，花葉褪綠癥狀則愈嚴(yán)重，由此猜測(cè)該蛋白可能為致

2、病相關(guān)蛋白，而SP蛋白的致病機(jī)制目前還鮮有報(bào)道。為了了解RSV-SP蛋白的致病機(jī)制，本論文以RSV-SP作為誘餌蛋白篩選擬南芥酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，以期能夠篩選到與SP蛋白互作的關(guān)鍵蛋白因子。
　　本論文首先運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)篩選并驗(yàn)證與擬南芥RSV-SP互作的蛋白因子。構(gòu)建誘餌蛋白酵母雙雜交載體pGBKT7-SP，將其轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中。大量制備含pGBKT7-SP載體的AH109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入文庫(kù)質(zhì)粒，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于三

3、缺培養(yǎng)基中，選取生長(zhǎng)良好的菌落涂于含X-a-gal的四缺培養(yǎng)基上。挑取生長(zhǎng)良好且變藍(lán)的酵母菌落，搖菌并提酵母質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增插入片段大小，測(cè)序分析并進(jìn)行Blast比對(duì)。得到4個(gè)陽(yáng)性克隆，分別是捕光色素葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCB5)、羥苯基丙酮酸雙氧化酶(HPPD)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPB)。用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)篩選到的這3個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。先構(gòu)建pGADT7-HPPD，pGADT7-GAPB和pGADT7-LHCB5載體，將構(gòu)建載

4、體轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中并涂于三缺培養(yǎng)基上，挑選陽(yáng)性菌落劃線于含有X-a-gal的四缺培養(yǎng)基上。最后證實(shí)SP蛋白與HPPD、GAPB蛋白互作明顯，與LHCB5蛋白互作不強(qiáng)。由此得知HPPD和GAPB蛋白可能在與RSV-SP互作的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　此外，為了明確HPPD蛋白在與RSV-SP蛋白互作中的作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)載體、RNAi載體和啟動(dòng)子載體，為研究RSV-SP蛋白的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。將這三個(gè)已構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)