豬附紅細(xì)胞體α-烯醇化酶與宿主互作蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、豬附紅細(xì)胞體病是一種人畜共患病，豬感染后癥狀主要表現(xiàn)為黃疸、發(fā)熱和貧血。豬附紅細(xì)胞體主要以黏附于紅細(xì)胞的方式入侵宿主細(xì)胞，而這種黏附由黏附蛋白來調(diào)節(jié)，即在宿主細(xì)胞和黏附蛋白之間的一個(gè)很小的空間內(nèi)發(fā)生作用，但對這種粘附作用的功能性基因研究甚少。本試驗(yàn)構(gòu)建豬外周血單個(gè)核細(xì)胞酵母雙雜交 cDNA文庫，再構(gòu)建豬附紅細(xì)胞體α-烯醇化酶基因酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體，在構(gòu)建的豬外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC酵母表達(dá)文庫中篩選與豬附紅細(xì)胞體α-烯醇化酶相互作用

2、的宿主蛋白，并進(jìn)行鑒定。為豬附紅細(xì)胞體細(xì)胞粘附和侵襲機(jī)制在蛋白水平上提供基礎(chǔ)研究。
　　豬外周血單個(gè)核細(xì)胞酵母雙雜交 cDNA文庫構(gòu)建：為構(gòu)建豬外周血單個(gè)核細(xì)胞酵母雙雜交 cDNA文庫，本試驗(yàn)無菌采取建康豬抗凝血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，并提取細(xì)胞總 RNA。應(yīng)用 SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA（ds cDNA）。利用CHROMA SPINT+TE-400Columns純化柱純化ds cDNA，并與線性化的pGADT7-Re

3、c載體共轉(zhuǎn)化酵母菌菌株Y187，以同源重組的方式在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建PBMC酵母雙雜交cDNA表達(dá)文庫。結(jié)果顯示，總RNA濃度為1143 ng/μL，OD260/OD280為1.90，構(gòu)建的文庫容量為3.11x108 CFU/mL，隨機(jī)挑取了23個(gè)單個(gè)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定后發(fā)現(xiàn)插入的雙鏈cDNA片段平均長度約2000 bp，主要集中在400 bp-4000 bp之間，且文庫重組率為100％。此次構(gòu)建的cDNA文庫可用于酵母雙雜交篩選。

4、r>　　α-烯醇化酶誘餌載體pGBKT7-enolase的構(gòu)建：本試驗(yàn)為了替換α-烯醇化酶基因序列中的終止密碼子，根據(jù)發(fā)表的豬附紅細(xì)胞體全基因組序列（NC-015153.1），設(shè)計(jì)并合成了三對引物，利用Overlap PCR定點(diǎn)突變，擴(kuò)增得到了全長基因序列，再將其與pMD18-T Simple Vector克隆載體連接，通過雙酶切將α-烯醇化酶基因全長序列定向克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7上，構(gòu)建了誘餌載體 pGBKT7-enolase

5、，并對其進(jìn)行了測序、自激活和毒性作用鑒定。結(jié)果顯示，Overlap PCR擴(kuò)增得到α-enolase全長為1623 bp，測序結(jié)果與NCBI上α-enolase基因序列比對存在23處堿基突變和1處氨基酸突變，核苷酸同源性98.6%，氨基酸同源性99.8%。將 pGBKT7-enolase轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài) Y2H，菌落 PCR表明pGBKT7-enolase成功轉(zhuǎn)入，毒性作用試驗(yàn)證明pGBKT7-enolase對酵母細(xì)胞生長無毒性，自激活試

6、驗(yàn)證明pGBKT7-enolase對酵母雙雜交報(bào)告基因無自激活現(xiàn)象。說明構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-enolase可用于酵母雙雜交篩選。
　　酵母雙雜交篩選與α-烯醇化酶互作的宿主蛋白：為篩選互作蛋白，本試驗(yàn)將誘餌載體 pGBKT7-enolase轉(zhuǎn)化酵母菌 Y2H，將其與轉(zhuǎn)化了外周血單個(gè)核細(xì)胞dscDNA的Y187酵母菌在50mL2×YPDA營養(yǎng)液體培養(yǎng)基（Kan）進(jìn)行雜交篩選。結(jié)果顯示，在SD/-4缺陷固體培養(yǎng)基（Kan）上長

7、出了162個(gè)白色、邊緣整齊、隆起的單菌落。單菌落轉(zhuǎn)移到 SD/-4/X/A板上后有33個(gè)菌落變成了藍(lán)色。利用文庫通用引物 PCR擴(kuò)增藍(lán)色菌落，1.0%凝膠電泳顯示條帶主要集中在250-2000 bp之間，測序后比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)有四種蛋白與試驗(yàn)相符，分別是24號(hào)蛋白endonuclease/reverse transcriptase、25號(hào)蛋白beta actin，partial、26號(hào)蛋白60S ribosomal protein L11，

8、partial和28號(hào)蛋白clusterin precursor，且克隆數(shù)分別為3、4、3和1。
　　共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)鑒定互作蛋白：將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)純化后，分對照組和試驗(yàn)組，并分別將各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于Y2H酵母感受態(tài)中，150mm SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A平板（Kan）30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3-4d。結(jié)果顯示，pGADT7-24、pGADT7-25、pGADT7-28+pGBKT7-enolase三個(gè)組分別在

9、SD/-4和SD/-4/X/A平板上長出了白色和藍(lán)色菌落，這與文庫篩選結(jié)果相符。而pGADT7-24+pGBKT7組在SD/-4和SD/-4/X/A平板上長出了白色和藍(lán)色菌落，這與預(yù)期結(jié)果不符，為假陽性蛋白，表明24號(hào)蛋白Endonuclease/reverse transcriptase存在自激活，即在沒有α-enolase基因存在的條件下能自己激活酵母雙雜交報(bào)告基因，固在后續(xù)試驗(yàn)中我們對其將不再研究。而26號(hào)蛋白60S riboso

10、mal protein L11在所有其組中均未出現(xiàn)任何菌落，可能是由于酵母質(zhì)粒提取不完整或轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)未成功造成。25號(hào)蛋白beta actin重復(fù)性比較高，通過資料分析，beta actin為β-肌動(dòng)蛋白，此蛋白有高度保守的基因序列，mRNA的表達(dá)數(shù)量高。常用于mRNA內(nèi)標(biāo)，在核酸酶保護(hù)分析中也可作為外標(biāo)。推測β-肌動(dòng)蛋白可能是豬附紅細(xì)胞體與宿主互作蛋白中的重要蛋白。
　　本試驗(yàn)為豬附紅細(xì)胞體與宿主互作蛋白的深入研究以及豬