羊附紅細胞體病流行病學(xué)調(diào)查及豬附紅細胞體粘附作用研究.pdf

1、附紅細胞體附著于豬、羊等動物的紅細胞表面，會引起患病動物溶血性貧血、黃疸、發(fā)熱以及生殖系統(tǒng)紊亂等癥狀。該病原在我國多省份流行，具體的入侵機理尚不清楚，常呈潛伏感染和混合感染狀態(tài)。目前已報道的診斷方法中尚無特異性診斷羊附紅細胞體病的方法，在臨床上常因不能及時發(fā)現(xiàn)該病原的存在，從而導(dǎo)致羊的繼發(fā)感染或死亡。本研究首先建立了半巢氏PCR診斷方法，并對湖北省羊附紅細胞體病的流行情況做了初步的調(diào)查。另外本實驗還探討了豬紅細胞膜蛋白Band3、Gly

2、cophorins A(GPA)與豬附紅細胞體粘附相關(guān)蛋白GAPDH、OSGEP的相互作用，從蛋白質(zhì)水平探究了附紅細胞體的致病機理。
　　1、羊附紅細胞體半巢氏PCR診斷方法的建立
　　根據(jù)GenBank中羊附紅細胞體16SrRNA基因序列(EU165509.1)，設(shè)計引物并建立半巢式PCR方法。新建立的方法敏感性高達10-10fg，特異性試驗分析表明與豬附紅細胞體、牛溫氏附紅細胞體、綿羊肺炎支原體、瑟氏泰勒蟲以及東方巴貝斯

3、蟲均無交叉反應(yīng)。
　　2、湖北省羊附紅細胞體病流行情況調(diào)查
　　從湖北省七個不同地區(qū)共采集371份羊血液樣本，用建立的半巢式PCR和報道的通用PCR(Neimark et al 2004)檢測羊附紅細胞體。半巢氏PCR檢測出151(41％)份陽性，而通用PCR僅檢出97(26％)份陽性。通過比對長江南北的樣品以及不同性別的樣品并經(jīng)SPSS20.0分析發(fā)現(xiàn)，羊附紅細胞體病在湖北省各地區(qū)均存在，長江以北地區(qū)的感染率(47％)高于

4、長江以南地區(qū)(31％)且差異顯著(P＜0.05)，而性別差異不顯著(P＞0.05)。本研究證實半巢式PCR比通用PCR更敏感，更適合于檢測羊附紅細胞體以及流行病學(xué)調(diào)查。
　　3、紅細胞膜蛋白與附紅細胞體相關(guān)粘附蛋白互作蛋白的篩選
　　利用膜蛋白提取方法從血液中提取了天然的紅細胞膜蛋白，并以此為模板進行Far-western blotting(Far WB)實驗，實驗中首先用BCA試劑盒測定帶HIS標(biāo)簽的GAPDH、OSGEP

5、蛋白濃度，將濃度統(tǒng)一稀釋為5μg/mL后與天然紅細胞膜蛋白孵育過夜，結(jié)果表明GAPDH、OSGEP可與多種紅細胞膜蛋白作用，其中Band3、GPA兩種蛋白作用最為明顯。
　　4、豬紅細胞膜蛋白Band3、GPA基因的克隆與原核表達
　　根據(jù)豬紅細胞膜蛋白Band3、GPA基因序列設(shè)計兩對特異性引物，從15日齡的小豬脾臟和骨髓中提取RNA，并從反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴增得到目的片段，構(gòu)建克隆質(zhì)粒后測序鑒定，測序結(jié)果顯示Band

6、3、GPA片段大小分別為1077bp和495bp，構(gòu)建GST標(biāo)簽原核表達質(zhì)粒pGEX-6P-1-Band3、pGEX-6P-1-GPA，在E.coli BL21中的表達產(chǎn)物經(jīng)Western blot(WB)檢測分析，結(jié)果顯示兩種蛋白均高效表達。對目的片段的最佳表達條件的摸索，結(jié)果顯示BL21/pGEX-6P-1-Band3、BL21/pGEX-6P-1-GPA最佳誘導(dǎo)條件為37℃5h，ITPG最佳誘導(dǎo)濃度是分別為0.8mmol/L、0.

7、6mmol/L。
　　5、紅細胞膜蛋白與附紅細胞體相關(guān)粘附蛋白互作蛋白的驗證
　　在最佳條件下表達Band3、GPA重組蛋白用于His-tag pull-down實驗，最后洗脫液經(jīng)WB分析均為Bait與Prey兩種蛋白條帶，結(jié)果表明Band3/GPA可以分別和GAPDH/OSGEP相互作用。
　　本研究一方面建立了針對羊附紅細胞體病的敏感、特異的semi-nested PCR，并對湖北省該病流行情況作了初步的調(diào)查與分析