人附紅細(xì)胞體病的診斷及臨床模式的建立.pdf

1、目的：⑴通過吉姆薩染色、吖啶橙染色法觀察臨床疑似感染附紅細(xì)胞體病的患者，以此建立起人附紅細(xì)胞體病的顯微鏡檢診斷技術(shù)。⑵比對鼠、貓、狗、豬、牛、羊的附紅細(xì)胞體16S RNA基因的同源性設(shè)計引物，設(shè)計出兩對特異性引物。⑶通過兔紅細(xì)胞泥與人附紅細(xì)胞體混合體外增殖培養(yǎng)，觀察感染后結(jié)果。同時，利用不同劑量人工接種成體家兔，觀察感染后家兔進(jìn)行分析，期望為人附紅細(xì)胞體病防治積累更多的資料。
　　 方法：采集在內(nèi)蒙古醫(yī)科大附屬醫(yī)院就診的疑似被感

2、染附紅細(xì)胞體病原體的42患者血液、已確診感染附紅細(xì)胞體的32例患者血液、非感染者10名的血液，通過吉姆薩染色、吖啶橙染色觀察疑似患者紅細(xì)胞形態(tài)及其病原體生長、繁殖狀況，結(jié)合臨床癥狀，來初步確診是否感染附紅細(xì)胞體病病原體。然后設(shè)計兩對特異性引物，一對為同源性較高區(qū)域特異性引物，另外一對為包括可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)的特異性引物。最后通過PCR技術(shù)，以疑似患者血液提取DNA為模板，來擴增特異性序列，以此來診斷是否被感染附紅細(xì)胞體病。另外，利用DNAM

3、AN生物信息學(xué)軟件對Gene Bank已經(jīng)公布的五種物種16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育樹建立。將胎牛血清和RPMI-1640以40％比例混合并添加肌苷作為體外增殖人附紅細(xì)胞體的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以兔紅細(xì)胞泥作為培養(yǎng)寄生載體，接種人附紅細(xì)胞體感染的紅細(xì)胞，置于5％ CO2、37℃培養(yǎng)。
　　 結(jié)果：①通過吉姆薩染色，顯示紅細(xì)胞形態(tài)大小不一，多見球形狀態(tài)的紅細(xì)胞，且點狀和桿狀很少。附紅細(xì)胞體寄生在紅細(xì)胞表面，也有的游離在

4、血漿之中。同樣，通過吖啶橙染色，得到的結(jié)果與吉姆薩染色結(jié)果類似，紅細(xì)胞形態(tài)多是不規(guī)則形狀，附紅細(xì)胞體呈寄附狀態(tài)。②設(shè)計兩對特異性引物，分別是1號引物Forward:TACGGGAAGCAGCAGTAG(GA)GGAAT和Reverse:TTCAC(T)CCCGATATAGCTGACACG(A)GG;2號引物Forward:GTGGG(T)AGCAAATGGGATTAGA和Reverse:TAGTTTGACGGGCGGTGTGTACAA。

5、通過提取血液基因組，以基因組DNA為模板，特異性引物克隆16S rRNA基因片段，以此來確診。③根據(jù)Gene Bank公布的鼠、貓、豬、牛、羊的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列，進(jìn)行序列比對并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，為研究人類感染的附紅細(xì)胞體16SrRNA基因提供進(jìn)化理論支持。④人附紅細(xì)胞體體外增殖培養(yǎng)，每隔24h換培養(yǎng)液、傳代，可連續(xù)傳代40次以上，維持感染率90％以上;接種兔紅細(xì)胞，36h后感染率可達(dá)90％以上，且持續(xù)到96h，此后少量