豬附紅細(xì)胞體PCR-ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬附紅細(xì)胞體病(Mycoplasma suis)是由豬附紅細(xì)胞體引起的，以發(fā)熱、貧血、黃疽等為主要臨床癥狀的人畜共患病，能引起仔豬貧血、稽留熱，育肥豬生長(zhǎng)發(fā)育遲緩以及母豬不孕、流產(chǎn)等生理障礙，并可通過(guò)血液等多種方式傳播，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康。目前針對(duì)于豬附紅細(xì)胞體病尚未研制出特效藥物，所以盡早地檢測(cè)和掌握豬附紅細(xì)胞體的感染狀況對(duì)該病的有效控制十分重要。為此，本試驗(yàn)建立了一種敏感、特異、安全和省時(shí)的豬附紅細(xì)胞體PCR-ELI

2、SA檢測(cè)方法。
　　首先根據(jù) GenBank上發(fā)布的豬附紅細(xì)胞體 OxaA膜蛋白基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)常規(guī)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得豬附紅細(xì)胞體的目的基因片段（Ms232），并將其克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建pMD18-T-Ms232重組質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切鑒定后送往測(cè)序，完成目的基因的鑒定。參照常規(guī)引物序列，分別在上游和下游引物的5'端標(biāo)記生物素(BIOT)和地高辛(DIG)，合成一對(duì)標(biāo)記引物，并在相同條件下，以此為引物進(jìn)行PCR

3、擴(kuò)增，得到在兩端分別帶有以上2種標(biāo)記物的目的基因片段。將該目的基因的PCR產(chǎn)物加入以鏈霉親和素包被的酶標(biāo)板中，目的基因通過(guò)其一端的生物素與鏈霉親和素相結(jié)合固定于孔底。接著加入堿性磷酸酶(AKP)標(biāo)記的抗地高辛抗體，使其與目的基因另一端的地高辛發(fā)生反應(yīng)，最后加入相應(yīng)的底物進(jìn)行顯色，并檢測(cè)其OD405nm值。同時(shí)，通過(guò)標(biāo)記方法改良、平臺(tái)期摸索、方陣滴定等方法對(duì)PCR擴(kuò)增、包被液濃度、封閉條件等環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最優(yōu)的條件。
　　結(jié)果

4、顯示所設(shè)計(jì)的常規(guī)引物可準(zhǔn)確擴(kuò)增豬附紅細(xì)胞體的目的基因片段，保證了標(biāo)記引物的有效性。各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果表明，所建立的PCR-ELISA檢測(cè)方法的敏感度為0.36 pg豬附紅細(xì)胞體基因組DNA，比常規(guī)PCR高10倍，且不與豬鏈球菌、豬肺炎支原體、犬附紅細(xì)胞體等基因組DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性。通過(guò)優(yōu)化，該方法較傳統(tǒng)PCR-ELISA法可節(jié)約近2 h。對(duì)73份豬被檢血液的陽(yáng)性檢出率為42.5％，高于常規(guī)PCR法的34.2%。
　　本