奶牛附紅細(xì)胞體病PCR檢測(cè)方法的建立及其病原生物學(xué)初步研究.pdf

1、奶牛附紅細(xì)胞體病是一種日益受到人們關(guān)注的人畜共患病，病原是牛溫氏附紅細(xì)胞體。該病近年來(lái)給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)目前國(guó)內(nèi)還尚未在分子水平上證實(shí)該病原的存在，對(duì)其分類(lèi)學(xué)地位不清楚及鏡檢作為檢測(cè)該病普遍采用的方法存在許多不足等情況。本文對(duì)奶牛附紅細(xì)胞體的16SrRNA基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序，并依此建立系統(tǒng)發(fā)肓進(jìn)化樹(shù)，旨在從分子水平上確定其分類(lèi)學(xué)地位。并且根據(jù)所得16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了奶牛感染附紅細(xì)胞體的PCR診斷

2、方法。 本研究利用原核生物16SrRNA基因通用引物27F和1492R對(duì)分離純化的疑似奶牛附紅細(xì)胞體進(jìn)行16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，目的片段長(zhǎng)度為1439bp，其核苷酸序列與國(guó)外已發(fā)表的牛溫氏附紅細(xì)胞體(E.wenyoni)的16SrRNA基因片段同源性高達(dá)97.1﹪，暫稱為中國(guó)廣西株(E.wenyoni-CGX)；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，E.wenyoni-CGX和其它血營(yíng)養(yǎng)菌在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上組成了一個(gè)

3、大的進(jìn)化分支，與支原體科、支原體屬的病原最接近(75﹪)，而與立克次氏體科的病原較遠(yuǎn)(55﹪)。分析結(jié)果支持了Neimark等和Messick等提出的將這類(lèi)血營(yíng)養(yǎng)菌劃歸入支原體科、支原體屬的建議。 同時(shí)，根據(jù)測(cè)序得到的奶牛附紅細(xì)胞體16SrRNA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)種特異性引物，建立奶牛附紅細(xì)胞體病的PCR診斷方法。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，該診斷方法與豬肺炎支原體、雞毒支原體、大腸桿菌、腸道沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、雞艾美耳球蟲(chóng)、牛

4、雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)；能檢測(cè)的奶牛附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血樣DNA最低濃度為0.154ng/μL，同時(shí)能檢測(cè)出在4℃存放長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月的血樣。通過(guò)臨床血樣檢測(cè)，證明該方法可以用于本病的診斷。 另外，建立了奶牛附紅細(xì)胞體病和伊氏錐蟲(chóng)病的二重PCR診斷方法，其擴(kuò)增片段大小分別為415bp和227bp。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，該方法與豬肺炎支原體、大腸桿菌、葡萄球菌、雞艾美耳球蟲(chóng)、牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)；能檢測(cè)的奶牛附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血液

5、DNA最低濃度和伊氏錐蟲(chóng)陽(yáng)性血液DNA最低濃度分別為0.43ng/μL和0.106ng/μL。臨床試驗(yàn)表明，該方法可用于奶牛附紅細(xì)胞體病和伊氏錐蟲(chóng)病的診斷。 為了初步探索不同種動(dòng)物附紅細(xì)胞體之間是否存在交叉感染，本研究首先摸索體外培養(yǎng)水牛紅細(xì)胞的最佳條件，然后用染色鏡檢為附紅細(xì)胞體陽(yáng)性的人、奶牛、小白鼠、狗、貓和兔紅細(xì)胞在體外感染陰性的水牛紅細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)PH值為7.2，CO2為6﹪，1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)，含胎牛血清40﹪

6、的完全培養(yǎng)基可用于水牛紅細(xì)胞的培養(yǎng)，在體外可以成功培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)30天；在體外交叉感染試驗(yàn)中，奶牛和貓的附紅細(xì)胞體最易感染水牛，其感染率可達(dá)60﹪以上，其次是小鼠和狗，其感染率在30-40﹪之間，最低為兔，感染率只能達(dá)到15﹪，而人的附紅細(xì)胞體在體外不能感染水牛紅細(xì)胞。 本研究通過(guò)對(duì)不同種動(dòng)物附紅細(xì)胞體血液涂片染色、體外培養(yǎng)及體外交叉感染，一定水平上反應(yīng)了不同種動(dòng)物附紅細(xì)胞體間的生物學(xué)聯(lián)系與區(qū)別。通過(guò)對(duì)奶牛附紅細(xì)胞體16SrRNA基因