東北三省豬附紅細(xì)胞體病分子流行病學(xué)調(diào)查及LAMP檢測方法的建立.pdf

1、附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生于多種動物和人的紅細(xì)胞表面及血漿、骨髓內(nèi)，以溶血性貧血、黃疸、發(fā)熱為主要臨床癥狀的人獸共患病。為了解東北三省豬附紅細(xì)胞體病的流行狀況及基因變異情況，本試驗應(yīng)用PCR技術(shù)對東北三省的600份豬血液樣本進行了檢測，并選取相對保守的16S rRNA核苷酸序列作為分析對象，對吉林株、遼寧株和黑龍江株豬附紅細(xì)胞體16S rRNA核苷酸序列進行測序，比對其核苷酸序列。結(jié)果表明，黑龍江省豬附紅細(xì)胞體陽性率為93.5％

2、r>　　（187/200），遼寧省豬附紅細(xì)胞體陽性率為89.5%（179/200），吉林省豬附紅細(xì)胞體陽性率為91.5%（183/200）。同源性分析顯示，黑龍江株、遼寧株與廣東株豬附紅細(xì)胞體基因同源性最高，均達到100%；吉林株與美國株豬附紅細(xì)胞體的基因同源性最高，為97%。系統(tǒng)進化分析顯示，黑龍江株與遼寧株豬附紅細(xì)胞體親緣關(guān)系最近，而與吉林株豬附紅細(xì)胞體較遠。研究表明，黑龍江省、遼寧省、吉林省豬附紅細(xì)胞體感染情況嚴(yán)重，吉林株、遼寧株

3、和黑龍江株豬附紅細(xì)胞體16S rRNA核苷酸序列存在差異。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）是近年來發(fā)展起來的一項新型檢測技術(shù)，LAMP技術(shù)以其特異性強、靈敏度高、快速準(zhǔn)確和操作簡單等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域，成為可以替代PCR方法的新的核酸擴增技術(shù)，在核酸的研究、疾病的診斷和預(yù)防、動物胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。鑒于國內(nèi)外尚未見應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測豬附紅細(xì)胞體的報道，本研究針對豬附紅

4、細(xì)胞體的16S rRNA基因的保守區(qū)用LAMP在線設(shè)計引物軟件設(shè)計引物,對內(nèi)引物濃度、外引物濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等反應(yīng)參數(shù)進行優(yōu)化，建立了LAMP診斷方法，并對建立的豬附紅細(xì)胞體LAMP檢測方法進行了敏感性、特異性及穩(wěn)定性評價。結(jié)果表明，利用LAMP技術(shù)成功檢測到豬附紅細(xì)胞體基因區(qū)，該方法的靈敏度可達到能檢測23.7 fg/μl，比PCR方法高10倍；未擴增出新孢子蟲、弓形蟲、瑟氏泰勒蟲的特異性條帶，具有較好的特異性；