四川省豬嵴病毒病流行病學(xué)調(diào)查及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬嵴病毒(Porcine kobuvirus)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)嵴病毒屬(Kobuvirus)成員。2008年，匈牙利學(xué)者首次報(bào)道在無(wú)臨床癥狀表現(xiàn)的豬糞便中發(fā)現(xiàn)豬嵴病毒;2009年，在中國(guó)豬群中也檢出了豬嵴病毒。自此之后，多個(gè)國(guó)家報(bào)道在豬群中檢測(cè)到豬嵴病毒，包括泰國(guó)、日本、韓國(guó)、荷蘭、巴西、西班牙、意大利、東非等。豬嵴病毒是一種具有傳染性、在世界范圍內(nèi)廣泛分布的新型病毒，在腹瀉豬中有較高檢出率，認(rèn)為可能

2、是豬腹瀉的病原，但鑒于其在沒(méi)有腹瀉的豬群中也普遍存在，且目前尚未能實(shí)現(xiàn)體外分離培養(yǎng)，需要更多的研究來(lái)闡明其生物學(xué)特性及病原特性。
　　本研究旨在對(duì)四川地區(qū)豬嵴病毒病流行情況進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)四川株豬嵴病毒VP1基因分子流行病學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析;VP1蛋白是嵴病毒暴露在最外面的結(jié)構(gòu)蛋白，是嵴病毒的優(yōu)勢(shì)免疫蛋白，本研究通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)，利用純化的重組蛋白建立一種檢測(cè)豬血清中豬嵴病毒抗體的間接ELISA

3、方法，為今后豬嵴病毒血清學(xué)診斷方法的研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究在2011-2012年從四川豬場(chǎng)中收集了163份豬糞便和腸道組織樣品，其中112份來(lái)自腹瀉豬，51份來(lái)自沒(méi)有腹瀉的豬。利用RT-PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，豬嵴病毒的總陽(yáng)性率為53.4％(87/163)，腹瀉樣品中豬嵴病毒總檢出率為64.3％(72/112)，采集自無(wú)腹瀉豬的樣品中，豬嵴病毒的感染率為29.4％(15/51)。利用SPSS21.0軟件對(duì)腹瀉組數(shù)據(jù)和無(wú)腹瀉組

4、數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示豬嵴病毒感染和腹瀉具有極顯著相關(guān)性，x2=17.126，p=3.5×10-5;在哺乳仔豬、保育豬、育肥豬和成年母豬中，豬嵴病毒的感染率依次為:66.7％、39.1％、23.5％、40.0％，對(duì)四個(gè)年齡段感染數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，分析顯示哺乳仔豬和豬嵴病毒感染具有極顯著相關(guān)性，x2=10.941，p=9.4×10-4。腹瀉豬和幼齡豬可能對(duì)豬嵴病毒更易感。
　　利用RT-PCR擴(kuò)增豬嵴病毒VP1基因序列，通過(guò)分子

5、克隆，測(cè)序得到35個(gè)豬嵴病毒VP1基因序列（GenBank登錄號(hào):KF157917-KF157951），核苷酸序列相似性為80.7％-100％，氮基酸序列相似性為87.2％-100％。利用MEGA5.0軟件對(duì)豬嵴病毒VP1基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示本研究獲得的四川株豬嵴病毒分屬于四個(gè)大的分支，說(shuō)明多株豬嵴病毒在四川地區(qū)流行，進(jìn)化樹(shù)顯示豬嵴病毒VP1基因序列的分群無(wú)明顯地域性差異。通過(guò)序列分析，表明在兩只豬的糞便樣品中分別檢出3株

6、和2株豬嵴病毒共同感染，首次為多株豬嵴病毒共感染提供了依據(jù);通過(guò)重組分析軟件RDP和Simplot預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3株共感染的豬嵴病毒A1、A2、A3之間存在重組事件，A2序列的VP1區(qū)段可能是由于A1和A3之間發(fā)生重組產(chǎn)生的。重組事件的發(fā)生會(huì)推動(dòng)病毒基因組的進(jìn)化，導(dǎo)致基因多樣性的發(fā)生。
　　本研究通過(guò)BepiPred、Bcepred、DNAStar中Protean來(lái)預(yù)測(cè)分析豬嵴病毒VP1蛋白線性抗原表位，綜合各種預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇抗原表位

7、較集中、抗原指數(shù)較高的前半段(1-462bp)作為豬嵴病毒優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)，將選取的基因片段送公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化后合成基因，將合成的基因片段定向克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-VP1，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定37℃，0.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h為最佳誘導(dǎo)條件，重組蛋白大小為35.6KDa，以可溶性形式存在，在Western blo

8、t檢測(cè)中，通過(guò)Ni柱純化的VP1重組蛋白和豬嵴病毒陽(yáng)性血清存在特異性反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白具有良好的抗原性。
　　利用純化的重組蛋白作為包被抗原，初步建立豬嵴病毒抗體檢測(cè)間接ELISA方法，并對(duì)間接ELISA反應(yīng)的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，抗原的最佳包被濃度為2μg/mL，血清最適稀釋倍數(shù)為1∶200，37℃1h+4℃過(guò)夜為重組蛋白最適包被條件，5％脫脂奶粉封閉90min為最適封閉液和封閉時(shí)間，待檢血清溫育時(shí)間為60min，酶標(biāo)二抗

9、工作濃度為1∶6000，作用時(shí)間為60min，TMB底物作用時(shí)間為15min，陰陽(yáng)性臨界值為0.250。建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有較好特異性，與豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒6種常見(jiàn)豬病病原陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。建立的方法具有較好的重復(fù)性，批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，變異系數(shù)均小于10％。用建立的間接ELISA方法，對(duì)170份豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示65份血清為