水貂阿留申病病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及間接ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、近年來，受市場需求的刺激，水貂養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展。山東也成為了我國水貂的養(yǎng)殖大省。但是，隨著水貂養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，一些疫病也成為了制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。水貂阿留申?。ˋD）,作為毛皮動物三大疫病之一，會造成水貂的毛皮質(zhì)量的下降，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。但是，目前，還沒有專門的藥物或者疫苗來防治此病，只能通過檢疫淘汰病貂達(dá)到對貂群的凈化。因此，研究水貂阿留申病毒（ADV）在山東地區(qū)的分子生物學(xué)特點，建立一種特異性的檢測方法具有重要

2、意義。
　　本研究對檢測到的患水貂阿留申病的水貂臟器進(jìn)行研磨，將研磨液接種到貓腎細(xì)胞（CRFK）中分離培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)穩(wěn)定的病變后，提取細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果呈現(xiàn)阿留申陽性。將擴(kuò)增的序列進(jìn)行測序，與參考序列ADV-G比對后，核苷酸同源性達(dá)到92.6％。但是，隨著病毒傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞病變逐漸消失，PCR檢測呈現(xiàn)陰性。說明該病毒不能在貓腎細(xì)胞中穩(wěn)定傳代。時，我們對從山東省諸城某水貂養(yǎng)殖場采集的134份水貂實質(zhì)器官進(jìn)行檢測，

3、發(fā)現(xiàn)有37株呈現(xiàn)水貂阿留申病陽性，陽性率達(dá)到27.6%。對37株水貂阿留申病毒進(jìn)行VP2基因的擴(kuò)增并進(jìn)行序列測定。用生物軟件分析后發(fā)現(xiàn)，37株測序株間VP2基因核苷酸相似性為88%-99.8%，與GenBank中參考序列的相似性為88.0%-100%。并且，我們觀察到：山東地區(qū)水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突變位點。將測序株與參考株經(jīng)進(jìn)化樹分析后，分成5個分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。VP2基因進(jìn)化樹顯示89%的國內(nèi)毒株處在進(jìn)化樹的第

4、Ⅰ和第Ⅴ分支，而這兩個分支不包含國外毒株。其中，有78.4%的毒株處在第Ⅰ分支。余下的11%的國內(nèi)毒株則與其他國外毒株有較近的親緣關(guān)系。這說明我國水貂阿留申病毒已經(jīng)有別于國外毒株，形成了自己的獨立進(jìn)化支。由于大多數(shù)分離到的毒株處于第Ⅰ分支，我們暫且認(rèn)為可能山東地區(qū)的毒株在向第Ⅰ分支進(jìn)化的趨勢。這對找出本地區(qū)流行的水貂阿留申病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株，以便進(jìn)行對該病的檢測提供科學(xué)依據(jù)。為了進(jìn)一步研究分離到的37株病毒VP2基因的分子特征，用DNAST

5、AR軟件分別推導(dǎo)出各基因片段的氨基酸序列，并與參考毒株進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：測序株間氨基酸的相似性為89.2%-99.7%，與參考序列間的相似性87.7%-100%?？v觀VP2的整個氨基酸序列中，突變較多,有超過100多個氨基酸的突變。突變較集中的區(qū)域有三個，其中包括免疫反應(yīng)區(qū)VP2:429-524。有14個突變位點只存在于中國毒株。其中，位點204：V-I、305:K-T、308:T-S、419：L-I、436：I-M的突變，突變毒

6、株超過10個。419：L-I、436：N-D兩個突變存在于VP2:428-446區(qū)域，而該區(qū)域可能影響水貂阿留申病毒的宿主范圍的選擇(McKenna et al.,1999)。對于其它幾個頻率較高的突變，我們目前還沒有確切的研究來表明它突變的意義。其次，本實驗室針對VP2序列的高免疫反應(yīng)區(qū)（430-525）進(jìn)行原核表達(dá)，并建立了間接ELISA檢測方法。將擴(kuò)增出的序列與pET-32a原核表達(dá)載體連接，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)劑