鴨圓環(huán)病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及診斷方法的建立.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的一新成員，2007年ICTV(The International Committee on Taxonomy ofViruses)將DuCV列入圓環(huán)病毒屬中的暫定種。DuCV感染可導(dǎo)致鴨子羽毛凌亂、生長遲緩、體重減輕等癥狀。本文擬從DuCV的流行病學(xué)調(diào)查、克隆測序及分子遺傳變異、人工感染的病理組織動態(tài)變化、建

2、立血清學(xué)檢測方法和體外組織細(xì)胞培養(yǎng)等方面進(jìn)行研究和探索。 1、山東省櫻桃谷鴨群中鴨圓環(huán)病毒及混合感染的流行病學(xué)調(diào)查 本研究旨在調(diào)查中國山東省櫻桃谷鴨(Cherry Valley duck)群DuCV的感染與流行情況。2006-2007年間，從山東省70個櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖場隨機(jī)選取742只鴨，采用PCR和Dot-blot方法，對DuCV感染情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，被調(diào)查鴨中有33.29％感染了DuCV；3、4周齡的鴨

3、子較2周齡的更易感；PCR鑒定方法比Dot-blot敏感。此外，與DuCV陰性鴨比較，DuCV陽性鴨與鴨1型肝炎(25.50％vs7.47％)、鴨疫里默氏菌(23.48％vs8.28％)及大腸桿菌(16.19％vs4.85％)的混合感染率較高。調(diào)查顯示，DuCV在櫻桃谷鴨群中普遍存在，且DuCV呈陽性的鴨更易與其它病原發(fā)生混合感染。 2、鴨圓環(huán)病毒的克隆測序及序列分析 從中國大陸櫻桃谷鴨中得到LY0701、WF0701兩

4、株DuCV的全基因組，Genkank登錄號分別為EU022374，EU022375?；蛐蛄刑卣鞣治霰砻鳎@兩株病毒的基因組均具有以下分子特征：(1)頸環(huán)結(jié)構(gòu)；(2)滾環(huán)復(fù)制；(3)四個重復(fù)序列；(4)兩個主要開放閱讀框，分別編碼復(fù)制蛋白Rep基因和編碼衣殼蛋白Cap基因。通過與已發(fā)表的序列比較分析，所分離的兩株病毒分別在兩個分支上，LY0701株與臺灣T1、T2、T3株、中國LY0701同源性高達(dá)96.7％以上，位于一個分支上，WF0

5、701株則與美國株、德國株以及臺灣的T4株更為接近，同源性達(dá)到93.5％以上，位于另一分支上。 3、櫻桃谷鴨人工感染鴨圓環(huán)病毒的病理動態(tài)變化 本研究以已經(jīng)完成全基因組序列測定的LY0701株DuCV為研究材料，利用感染LY0701株的陽性病料人工接種DuCV陰性的3周齡健康雛鴨，分別于攻毒后第2、4、6、8周對發(fā)病鴨進(jìn)行病理觀察。結(jié)果表明，與對照組相比，LY0701株陽性病料感染的雛鴨臨床癥狀均出現(xiàn)發(fā)育不良，消瘦，羽毛凌

6、亂等現(xiàn)象。剖檢顯示胸腺、法氏囊、脾臟、肝臟不同程度出血、腫脹，其它內(nèi)臟器官病變不明顯。病理切片顯示胸腺、法氏囊、脾臟、肝臟出血，淋巴細(xì)胞壞死、崩解等變化。 4、DuCV Cap蛋白基因原核表達(dá)及產(chǎn)物免疫原性研究 根據(jù)已發(fā)表的DuCV LY0701株Cap基因序列，設(shè)計(jì)一對引物，以測序正確的LY0701株Cap基因質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段，以pGEX-6P-1為載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株，挑選陽性克隆，測

7、序驗(yàn)證正確后，分別進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE電泳表明，表達(dá)產(chǎn)物的條帶大小與理論值相符。利用原核表達(dá)產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，制備抗Cap蛋白的血清，標(biāo)記為Ab-Cap。以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，建立了間接免疫熒光染色法(IFA)。利用Ab-Cap對人工感染病料的檢測表明，在脾臟、法氏囊、胸腺、肝臟的冷凍切片中可檢測到被熒光染色的完整的細(xì)胞；在心臟、肺臟、腎臟等病料中未檢測到熒光染色的陽性細(xì)胞。 為進(jìn)一步確定IFA檢

8、測的敏感性，臨床上分別收集疑似DuCV感染的96只鴨子的胸腺、法氏囊、脾臟、肝臟、骨髓，利用IFA進(jìn)行DuCV檢測。結(jié)果表明，當(dāng)鴨子感染DuCV后，脾臟的病毒檢出率最高，達(dá)到18.75％，其它臟器的病毒檢出率從高到低依次為法氏囊、肝臟、胸腺。利用Ab-Cap對臨床病例檢測表明，該方法更適合用于8周齡以上鴨子的脾臟檢測。 5、DuCV在不同組織及細(xì)胞中培養(yǎng)的探討 對PCR檢測DuCV強(qiáng)陽性的5份病料(LQ76，LQ66，L