基于豬附紅細胞體α-烯醇化酶基因的LAMP檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、豬附紅細胞體病(Eperythrozoonosis)是由豬附紅細胞體（Mycoplasma suis，M.suis）寄生于豬的紅細胞、血漿、組織液和骨髓中引起的一種多發(fā)性人獸共患傳染病。感染宿主范圍較廣，如豬、牛、山羊、狗、貓等，也包括人類。多呈隱性感染使機體免疫力下降，而導致與其它豬傳染病混合感染或繼發(fā)感染，嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生的危害較大。
　　采取早期診斷是預防豬附紅細胞體病的關鍵，常規(guī)的診斷方法

2、有涂片鏡檢、ELISA、PCR等，但由于這些診斷方法均需要特殊的儀器和設備，以及使用者應該具備一定的專業(yè)操作技能，而不能在基層養(yǎng)殖場進行推廣應用。環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)是Notomi等人建立的一種新型核酸擴增方法，可以精準識別出靶序列的4-6個特殊區(qū)域，通過BstDNA聚合酶在恒定的溫度條件下，快速擴增目的基因，經電泳形成梯形條帶或SYB

3、R Green I染料染色后直接觀察結果。LAMP具有反應快、效率高、不需要特殊儀器和可直接觀測結果等優(yōu)點，使其成為廣大養(yǎng)殖場自行診斷動物傳染病的新型熱門方法。近幾年，M.suis才被鑒定劃歸為支原體屬（Mycoplasma），其基因組也剛被國外學者測通。α-烯醇化酶基因(α-enolase，eno)是新報道的具有粘附作用的豬附紅細胞體表面功能蛋白，常被用于分子生物學診斷方法的目的基因。
　　因此，本試驗依據(jù)GenBank已發(fā)表的

4、M.suis基因組(NC-015153.1)設計一對特異性引物，擴增M.suis的部分α-烯醇化酶基因，經TA克隆和測序，根據(jù)測序正確的α-烯醇化酶基因，在基因保守區(qū)內設計一套LAMP特異性引物，進行LAMP預試驗，對其反應溫度、時間、Mg2+濃度等條件進行優(yōu)化篩選，并進行敏感性、特異性、重復性試驗，將建立的LAMP方法用于M.suis的臨床檢測。結果表明，本試驗成功克隆到M.suis的部分α-烯醇化酶基因，長度為864bp。建立的LA

5、MP方法的最適反應溫度為63℃，Mg2+最適濃度為6mmol/L，內外引物最適濃度比為1∶6，可在50 min內完成檢測反應，并且通過SYBR GreenⅠ染料染色后可直接觀察結果。特異性試驗顯示，對弓形蟲、豬鏈球菌Ⅰ型、大腸桿菌和牛源瑟氏泰勒蟲的基因組均無擴增，證明該方法具有良好的特異性;敏感性試驗顯示，可以檢測的最低稀釋倍數(shù)為10-6倍，即30 copies/μL，比普通PCR方法的敏感度高100倍，證明該方法具有較高的敏感性;重復