豬附紅細(xì)胞體ORFs基因合成、表達(dá)及鑒定.pdf

1、豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis，M.suis）在伯杰氏手冊中被劃分為立克次氏體，但目前國際上根據(jù)其16sRNA序列，普遍認(rèn)為應(yīng)屬于支原體。M.suis是一種寄生于豬紅細(xì)胞上的微生物，能夠引起豬的溶血性貧血、黃疸等為主要特征的血液感染性疾病。近幾年豬附紅細(xì)胞體病在全國范圍內(nèi)大面積爆發(fā)和流行，對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。為更好的控制該病的發(fā)生，必須從該病的病原上對其進(jìn)行詳細(xì)的研究。在Genebank中可以查到的能夠表達(dá)成

2、蛋白質(zhì)的序列共有5條，分別是rnpB，無機(jī)磷酸酶，MSG1，HspA1和豬附紅細(xì)胞體ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7、ORF8、ORF9、ORF10、ORF11 DNA序列，Hoelzle等通過鳥槍法對M.suis基因組文庫進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了MSG1蛋白，該蛋白與3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）具有高度同源性，并且該蛋白是具有粘附豬紅細(xì)胞功能的M.suis 膜蛋白，不同的分離株中MSG1的序列高度保守

3、，并且證明HspA1蛋白具有三磷酸腺苷酶活性和抗原性，但對rnpB，無機(jī)磷酸酶和ORFs的功能知之甚少。
　　 由于M.suis沒有最佳的培養(yǎng)方式，很大程度上限制了我們對M.suis的研究。而且M.suis編碼的基因采用的是第4套密碼子，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有沖突，具體來說就是M.suis編碼的TGA為色氨酸，但TGA在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中編碼的卻為終止密碼子。因此，在本次試驗(yàn)中，我們根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬附紅細(xì)胞體AJ50

4、4999序列的ORF2，ORF4，ORF5，ORF9基因，將密碼子TGA改為TGG，并利用Graphical Codon UsageAnalyser，將難以表達(dá)的大腸桿菌稀有密碼子更換為易于表達(dá)的密碼子。采用人工設(shè)計(jì)的引物，在最兩端的引物上分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，利用引物相互重疊覆蓋整個(gè)ORF2，ORF4，ORF5，ORF9基因序列，從而得到整個(gè)ORF2，ORF4，ORF5，ORF9基因序列。
　　 先將ORFs基因連接到PMD18-

5、T simple載體上，測序發(fā)現(xiàn)ORF2在518位發(fā)生基因缺失，又設(shè)計(jì)了OE-PCR的引物，將缺失的基因填補(bǔ)上，將測序正確的ORF基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a及pET32a，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET-28a/ORF2，PET-28a/ORF4，PET-32a/ORF5，PET-32a/ORF9，并轉(zhuǎn)入E.coli BL21中，在IPTG終濃度1mmol/L的條件下誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，Western-blot鑒定，目的