重慶地區(qū)牛附紅體病分子流行病學調(diào)查及黃牛附紅體RAPD—SCAR標記的建立.pdf

1、附紅細胞體(Eperythrozoon)寄生于宿主的紅細胞表面或游離于血漿、組織液及腦脊液中?？筛腥旧窖颉⑴?、豬、馬、綿羊、鼠、犬、藍狐、雞等多種動物及人類。對世界多數(shù)國家的畜禽業(yè)養(yǎng)殖造成了較大的經(jīng)濟損失。本研究根據(jù)Genbank上公布的牛附紅細胞體16S rRNA基因序列進行牛附紅細胞體16S rRNA基因擴增的特異性引物設計。直接對感染了牛附紅細胞體的牛全血DNA進行PCR擴增，成功擴增出黃牛、奶牛和水牛的16S rRNA基因序列，

2、建立了關于牛附紅細胞體病更為簡便的試驗室診斷方法。通過對擴增出的黃牛、奶牛和水牛感染的附紅細胞體部分16S rRNA基因的序列測定與分析，發(fā)現(xiàn)在不同品種牛感染的附紅細胞體均屬于溫氏附紅細胞體，但存在一定的遺傳差異，其中黃牛與水牛感染的附紅細胞體16S rRNA基因相似率為98.6％；黃牛與奶牛感染的附紅細胞體16S rRNA基因相似率為98.3％；而奶牛與水牛感染的附紅細胞體16S rRNA基因同源性最高，其相似率為99.8％。表明建立

3、的PCR特異性檢測方法可以用于鑒別牛血液是否感染了附紅細胞體。 根據(jù)重慶地區(qū)不同的地理條件和養(yǎng)殖模式，在重慶地區(qū)選擇14個區(qū)縣進行牛附紅細胞體病的分子流行病學調(diào)查，使用本試驗室建立的牛附紅細胞體特異性檢測方法與常規(guī)試驗室檢測方法相結合，調(diào)查結果發(fā)現(xiàn)，重慶市的大部分區(qū)縣牛體均有牛附紅細胞體的存在，其平均感染率為11％。而在不同的地理條件下該病的感染率存在較大的差異，其中以城口、武隆、秀山等為代表的山區(qū)牛附紅細胞體的平均感染率明顯(

4、25.6％)高于以榮昌、北碚、江北為代表的丘陵地區(qū)平均感染率(2％)，同時，不同的養(yǎng)殖模式條件下感染率也存在一定的差異，散養(yǎng)方式下牛的感染率在22.7％-33.3％之間，而規(guī)?；B(yǎng)殖條件下的平均感染率為6％。 關于附紅細胞體分類，主要依據(jù)對附紅細胞體的16S rRNA基因擴增和序列比對結果分析進行判定，但Pospischil A，Neimark H等人用16S rRNA基因分類卻得出不同的意見。表明僅使用16S rRNA基因擴增

5、和序列比對分析對附紅細胞體進行分類判斷具有一定的局限性。本試驗利用隨機擴增多態(tài)性DNA技術(RAPD)對E．wenyoni， E．suos和E．vois三種附紅細胞體16S rRNA基因序列進行分析。利用篩選出的4條隨機引物對5條E． wenyonii16S rRNA基因序列、2條E．suis16S rRNA和2條E． vois16s rRNA基因序列進行擴增，擴增結果顯示相同品種家畜體內(nèi)感染的附紅細胞體擴增條帶十分一致，不同動物感染的

6、附紅細胞體擴增條帶存在差異，其中感染牛、羊的附紅細胞體16S rRNA基因序列親緣關系最近，其遺傳距離指數(shù)為0.405；感染牛和羊的附紅細胞體與感染豬的附紅細胞體16S rRNA基因序列的親緣關系相對較遠，其遺傳距離指數(shù)分別為0.714和0.673，表明RAPD技術可用于對不同種畜間附紅細胞體16S rRNA基因序列進行遺傳距離分析，但不能應用于對同種動物感染的附紅細胞體16S rRNA基因序列進行遺傳距離分析。在對黃牛附紅細胞體16S

7、 rRNA基因序列RAPD分析的基礎上，進行SCAR標記的轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)建立的SCAR1和SCAR3標記既不能對E． wenyonii16S rRNA基因序列擴增出特異性條帶，也不能在其它感染了牛附紅細胞體的血液DNA中擴增山特異性條帶，而SCAR2既可以作為鑒別黃牛是否感染了附紅細胞體病的分子標記，也可以從感染黃牛、水牛和奶牛的附紅細胞體16S rRNA基因序列中鑒別出黃牛感染的附紅細胞體16S rRNA基因序列。表明RAPD—SCAR方