羊附紅細(xì)胞體生物學(xué)特性研究及其PCR和ELISA檢測方法的建立.pdf

1、為了研究附紅細(xì)胞體在體外生長變化的規(guī)律,為附紅細(xì)胞體的體外培養(yǎng)提供依據(jù),在羊附紅細(xì)胞體感染的血液中分別加入三種抗凝劑,試找出對羊附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon ovis)體外生長影響最大的一種抗凝劑.結(jié)果表明,檸檬酸鈉溶液能使附紅細(xì)胞體在體外血液中維持一定的數(shù)量.在檸檬酸鈉溶液中加入葡萄糖和NaHCO3,研究了營養(yǎng)成分的添加對羊附紅細(xì)胞體的影響.結(jié)果表明,在抗凝劑中添加葡萄糖和NaHCO3能顯著地提高附紅細(xì)胞體的數(shù)量.故在其后的

2、試驗(yàn)中,采用添加葡萄糖和NaHCO3的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑.根據(jù)附紅細(xì)胞體在離體后12h內(nèi)保持增殖活性的特性,血樣必須在采后12h內(nèi)處理.2002年1月~2002年12月,用鏡檢法對羊附紅細(xì)胞體病的流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查.對附紅細(xì)胞體的流行病學(xué)調(diào)查表明,附紅細(xì)胞體對羊的感染率有一定的季節(jié)性,與吸血昆蟲有一定的關(guān)系.寒冷季節(jié),附紅細(xì)胞體的感染率非常低,溫暖潮濕的春夏季節(jié),感染率呈上升趨勢,在炎熱的季節(jié),附紅細(xì)胞體的感染率非常高,常常達(dá)到80

3、％以上.對附紅細(xì)胞體進(jìn)行分子水平上的研究始見于20世紀(jì)80年代,隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展,對該病的研究也逐漸深入到分子水平上.該試驗(yàn)根據(jù)羊附紅細(xì)胞體的16S rRNA基因參考序列的保守區(qū),設(shè)計一對特異性引物(p1/p2),對羊附紅細(xì)胞體基因組DNA進(jìn)行了PCR檢測,擴(kuò)增出一段1000多bp的DNA序列,用EcoRI酶切,得到兩條500bp以上的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,說明PCR方法擴(kuò)增出了羊附紅細(xì)胞體的特異條帶.并經(jīng)交叉性和靈敏性試驗(yàn)證

4、明,該方法特異、靈敏、快速,可從分子水平上對附紅細(xì)胞體病進(jìn)行早期快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查,是一種理想的精確檢測該病的方法,能及時掌握該病的流行情況并迅速準(zhǔn)確地對可疑病例作出診斷,杜絕該病的大規(guī)模爆發(fā),對控制該病的大范圍流行具有重要意義.附紅細(xì)胞體病的診斷一直以來都是以鏡檢法作為標(biāo)準(zhǔn),然而由于附紅細(xì)胞體個體很小,鏡檢法有一定缺陷,并且缺乏特異性,故尋求一種快速、特異的診斷方法就成了當(dāng)務(wù)之急.本試驗(yàn)利用血清學(xué)技術(shù),摸索了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EL

5、ISA)的最佳工作條件.自行采集血液,提純抗原,用常規(guī)方法免疫家兔,制備陽性血清,進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),并與鏡檢法作比較,證明ELISA作為診斷羊附紅細(xì)胞體病的一種方法具有特異、靈敏、快速、高效的優(yōu)點(diǎn).以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體為酶標(biāo)二抗,最佳工作條件為抗原稀釋度64倍、陽性血清稀釋度160倍、酶標(biāo)二抗稀釋度1000倍,一抗和二抗的最佳反應(yīng)時間為1h.對羊附紅細(xì)胞體的最小檢出量為50.30 μ g/ml.與支原體、大腸桿