31317.利用反向ras拯救恢復(fù)系統(tǒng)篩選擬南芥g蛋白互作因子

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文利用反向Ras拯救恢復(fù)系統(tǒng)篩選擬南芥G蛋白互作因子姓名：苑國(guó)良申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：亓寶秀20090608利用反向Ras拯救恢復(fù)系統(tǒng)篩選擬南芥G蛋白互作因子1提取擬南芥2星期和三星期幼苗，成熟的葉片、莖、花的總RNA，以隨即引物為反轉(zhuǎn)錄引物，表達(dá)載體為pUraRas，構(gòu)建了eDNA文庫(kù)，1X105個(gè)克隆。2構(gòu)建pMet—WtGPAl，pMetQ222L兩種誘餌，借助反向Ras拯救恢復(fù)系統(tǒng)，篩

2、選得到若干GPAl推論的互作因子，如：ADLlC，ACCl，AtXB3l等。3通過(guò)酵母雙雜交，Pulldown，BiFC，ColP等體內(nèi)體外蛋白互作實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明AtXB31同GPAl的互作。其中酵母雙雜交的互作發(fā)現(xiàn)，AtXB31的N末端膜定位序列對(duì)于二者的互作是必需的。4對(duì)于AtXB3l結(jié)構(gòu)分析表明，該基因具有三個(gè)保守domain，分別為：N末端的膜定位序列，將蛋白定位在質(zhì)膜上；錨定重復(fù)序列(ankyrinrepeats)，參與蛋白

3、互作；C3HC4的環(huán)形鋅指結(jié)構(gòu)，具有潛在的E3連接酶的活性。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)。RTPCR檢測(cè)，該基因在植物的重要組織中均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)較高。GFP亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜上。經(jīng)ABA和病原菌處理之后，AtXB31表達(dá)量提高。5AtGPAl同AtXB31有可能共同調(diào)控病原菌Xcc8004信號(hào)途徑。通過(guò)對(duì)AtXB31的異位過(guò)表達(dá)和RNAJ敲除轉(zhuǎn)基因植株同野生型c01O形態(tài)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，基本沒(méi)有差別。分別對(duì)GPAI的無(wú)義突變體

4、gpal4和AtXB31過(guò)表達(dá)以及RNAi敲除植株接種病原菌，野生型作為對(duì)照。結(jié)果表明，gpal一4和AtXB31劇vA‘敲除植株均出現(xiàn)了疑似感病癥狀。并且已經(jīng)證明AtXB31在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)該病原菌。因此推論AtGPAl和AtXB31很有可能參與Xcc8004病原菌的信號(hào)調(diào)控。黃單胞菌是可造成植物嚴(yán)重病害的細(xì)菌，如黑腐病。因此研究該病原菌同植物之間的信號(hào)傳遞途徑，找出關(guān)鍵調(diào)控基因，對(duì)于防治該病原菌可提供重要理論依據(jù)。篩選、鑒定植物G蛋