油菜角果熱應(yīng)答基因鑒定和擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子互作分析.pdf

1、高溫是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的非生物脅迫因子之一。長(zhǎng)江流域是我國(guó)油菜的主產(chǎn)區(qū)，該地區(qū)在種子灌漿成熟期經(jīng)常遭遇短期或連續(xù)30度以上的高溫，造成種子高溫逼熟，嚴(yán)重影響種子產(chǎn)量和含油量。但目前還缺乏對(duì)油菜耐高溫逼熟的遺傳和分子基礎(chǔ)的了解。模式植物擬南芥中熱激轉(zhuǎn)錄因子研究已取得重要進(jìn)展，但如何有效應(yīng)用到作物遺傳改良還有待探索。針對(duì)這些問題，本研究主要開展了三個(gè)方面的工作:1）以開花20d后的油菜果皮和種子為材料，利用油菜95K表達(dá)序列芯片分析兩種組織在熱

2、處理后24h和48h基因表達(dá)變化的情況，為研究油菜抗熱反應(yīng)提供更廣泛的基因源。2）利用擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子多突變體，從表型、表達(dá)調(diào)控和蛋白互作分析以及遺傳調(diào)控途徑等方面研究HsfA與HsfB兩個(gè)亞家族基因的功能和潛在的調(diào)控關(guān)系。3）根據(jù)油菜熱激表達(dá)譜結(jié)果，以受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的擬南芥基因H38(AT4G23493)為分析對(duì)象，從基因表達(dá)、亞細(xì)胞定位、生理生化反應(yīng)以及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)等方面研究了其功能。主要研究結(jié)論如下:
　　1.在熱處理后

3、的油菜芯片中共檢測(cè)到1248個(gè)上調(diào)和898個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因，其中在果皮中檢測(cè)到925個(gè)上調(diào)和581個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，在種子中共檢測(cè)到837個(gè)上調(diào)和383個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。在果皮和種子中，這些轉(zhuǎn)錄水平的變化可能為揭示油菜角果期抗熱的分子機(jī)制提供線索。
　　2.上調(diào)基因中有40.9％(511)同時(shí)存在于種子和果皮中，然而下調(diào)表達(dá)的基因中只有66個(gè)同時(shí)存在于兩個(gè)組織中，并且上調(diào)基因的平均變化倍數(shù)(2.1-72.8)比下調(diào)(2.0-5.6)的

4、更加劇烈。在共同誘導(dǎo)表達(dá)的基因中，與脅迫相關(guān)的基因以及與RNA和蛋白質(zhì)相關(guān)等基因顯著富集，其中包括熱脅迫反應(yīng)的標(biāo)志性基因如Hsfs、Hsps、DREB2a、ROF2、GolS1和MBF1c等，以及CYP707A4和細(xì)胞色素bd泛醌氧化酶等以前未鑒定到的基因。
　　3.在果皮中共檢測(cè)到411個(gè)上調(diào)和514個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，而這些基因在種子中的表達(dá)沒有受到影響。其中，最突出的是21個(gè)參與硫苷代謝的基因被同時(shí)下調(diào)表達(dá)，另外一些表達(dá)改變的基

5、因則參與光合作用，水、糖分以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等幾個(gè)主要代謝途徑，這些基因表達(dá)量的變化可能與熱處理后油菜種子產(chǎn)量以及品質(zhì)直接相關(guān)。
　　4.在種子中檢測(cè)到325個(gè)上調(diào)和314個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，其在果皮中的表達(dá)沒有明顯變化。與果皮類似，我們共檢測(cè)到12個(gè)花青素合成途徑上的基因表達(dá)受到抑制，此外與種子儲(chǔ)藏蛋白、植物激素、油脂代謝等重要代謝途徑相關(guān)的基因的表達(dá)也發(fā)生變化。
　　5.在所有的差異表達(dá)基因中，有1/3編碼功能未知蛋白（果皮中有4

6、84個(gè)，種子中有398個(gè)），其中502個(gè)在擬南芥中能找到同源序列，181個(gè)則為油菜特有基因。因此，在植物中可能還存在許多與抗熱相關(guān)的功能未知基因以及物種特有基因。
　　6.根據(jù)芯片數(shù)據(jù)，我們挑選了8個(gè)基因并獲得了相應(yīng)的擬南芥突變體。在種子萌發(fā)、幼苗、成熟植株（開花之前）等多個(gè)時(shí)期對(duì)這些突變體進(jìn)行熱處理，發(fā)現(xiàn)h25、h29與h38至少在一種熱處理?xiàng)l件下表現(xiàn)熱敏感。
　　7.通過對(duì)雙突變體的分析發(fā)現(xiàn)，HsfA3位于HsfA2下游

7、協(xié)同調(diào)節(jié)Hsp18.1和Hsp25.3-P等的表達(dá)。采用酵母雙雜交的方法檢測(cè)到HsfA2與HsfA3可以通過各自的OD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行互作。利用HsfB的雙突變體和三突變體，從抗熱表型和靶標(biāo)基因的表達(dá)變化等角度闡述了HsfB的功能及其之間的關(guān)系。
　　8.在芯片中發(fā)現(xiàn)的熱應(yīng)答基因H38(AT4G23493)，在植物界中保守的。在擬南芥中，H38主要在成熟的種子以及萌發(fā)過程中高豐度表達(dá);其編碼的蛋白定位于線粒體。啟動(dòng)子和基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)H

8、38在幼苗以及發(fā)育的角果中能顯著被熱誘導(dǎo)。h38突變體在苗期對(duì)熱處理敏感，而在抽薹開花期熱處理時(shí)能夠顯著積累花青素。
　　9.采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)H38與GolS1、SK1、熱激蛋白AT5G37670和AT2G19310等基因共表達(dá)，采用熒光定量的方法分析了共表達(dá)基因以及抗熱的核心基因Hsf和Hsp和線粒體定位的抗熱關(guān)鍵基因的表達(dá)變化，明確了H38的功能與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　10.h38突變體的種子在萌發(fā)過程中對(duì)葡萄糖和ABA