菜用大豆轉(zhuǎn)錄因子GmPLZ及其互作蛋白的研究和菜豆ANK家族基因的鑒定.pdf

1、在農(nóng)作物的生長過程中，環(huán)境對(duì)其產(chǎn)生相應(yīng)的影響，尤其是非生物脅迫嚴(yán)重造成了品質(zhì)以及產(chǎn)量上不可估量的損失。因此針對(duì)作物的抗逆方面的機(jī)制以及挖掘抗逆相關(guān)的功能基因?qū)υ鰪?qiáng)和提高作物的抵抗逆特性境的性具有重要的意義，一些蛋白激酶、磷脂結(jié)合蛋白及轉(zhuǎn)錄因子均能在抵抗植物的逆境方面發(fā)揮著異常重要的作用。本文通過對(duì)過表達(dá)GmPLZ擬南芥的表型鑒定，發(fā)現(xiàn)GmPLZ轉(zhuǎn)錄因子在非干旱和高鹽脅迫下發(fā)揮重要作用，并通過對(duì)其抗逆機(jī)制的研究，篩選出與其互作的兩個(gè)候選蛋

2、白GmPAK蛋白激酶和GmCap磷脂結(jié)合蛋白。通過酵母雙雜交技術(shù)，驗(yàn)證了候選蛋白與GmPLZ轉(zhuǎn)錄因子之間的互作關(guān)系；另外利用綠色熒光GFP融合蛋白表達(dá)載體和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，對(duì)兩個(gè)候選蛋白GmPAK蛋白激酶和GmCap磷脂結(jié)合蛋白的分子特征進(jìn)行了描述，并闡述了GmPLZ轉(zhuǎn)錄因子在參與并提高植物對(duì)種種抗逆性方面的相對(duì)分子機(jī)制。通過對(duì)菜豆ANK家族基因的生物信息學(xué)、分子特征以及表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)ANK蛋白同樣在植物抵抗非生物脅迫

3、中扮演著重要的作用，結(jié)果如下：
　　1. GmPLZ基因的抗逆性分析。通過RT-PCR分析GmPLZ基因在干旱和鹽處理?xiàng)l件下呈現(xiàn)出來的上調(diào)表達(dá)，在干旱2h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高；在鹽脅迫條件下，24h時(shí)表達(dá)量體現(xiàn)出來的是達(dá)到最高。通過對(duì)GmPLZ過表達(dá)擬南芥的表型分析進(jìn)一步證明，該基因在抵抗干旱和高鹽脅迫中具有重要的作用。
　　2. GmPLZ互作蛋白的篩選。利用酵母雙雜交技術(shù)，構(gòu)建GmPLZ-pGBKT7誘餌表達(dá)載體，對(duì)與之相關(guān)

4、的旱、鹽脅迫的大豆cDNA文庫篩選，通過對(duì)篩選結(jié)果的測(cè)序以及GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其候選蛋白主要參與植物逆境脅迫響應(yīng)、生長發(fā)育和能量代謝等活動(dòng)，通過進(jìn)一步的研究并同時(shí)篩選出兩個(gè)與其相互之間產(chǎn)生作用的蛋白：GmPAK蛋白激酶和GmCap磷脂結(jié)合蛋白。
　　3.驗(yàn)證 GmPLZ與 GmPAK和 GmCap的互作。本文通過構(gòu)建 GmPAK-pGADT7和GmCap-pGADT7表達(dá)載體，并將其分別地共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過

5、雙雜驗(yàn)證與誘餌蛋白彼此之間的關(guān)系和作用，結(jié)果體現(xiàn)的是，在酵母體內(nèi)GmPLZ與GmCap、GmPAK確實(shí)存在彼此之間互作的關(guān)系，結(jié)果暗示GmPLZ在植物抵抗各種非生物脅迫的響應(yīng)中具有相當(dāng)重要的意義。
　　4. GmPAK和GmCap蛋白的分子特征及表達(dá)模式分析。通過構(gòu)建綠色熒光GFP融合表達(dá)載體GmPAK-GFP和GmCap-GFP，并將其分別轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GmPAK和GmCap蛋白都具有膜定位特征；通過磷酸化特異抗體

6、鑒定融合蛋白TF-His-GmPAK的自磷酸化活性。通過Real-time PCR分析，發(fā)現(xiàn)GmPAK基因在干旱缺水的脅迫條件下，上調(diào)趨勢(shì)表達(dá)，并在24h時(shí)達(dá)到了最高值；在高溫條件下，2h時(shí)達(dá)到最高的表達(dá)值；在NaCl和BR的處理?xiàng)l件下，各個(gè)時(shí)間段下沒有明顯的改變。該結(jié)果說明GmPAK基因受干旱缺水的調(diào)控。GmCap基因在干旱處理1h后表達(dá)量明顯趨于最大；但在高溫、NaCl以及BR脅迫下，表達(dá)量并沒有相對(duì)顯著的改變。這些結(jié)果說明GmCa

7、p基因在干旱的條件下變化是明顯的，受到干旱的脅迫表達(dá)。
　　5.菜豆ANK家族基因的系統(tǒng)分析。菜豆基因組中一共含有30個(gè)ANK家族基因，在所有的9條染色體上均有不同程度的分布，位于在第5條染色體上含有最多的數(shù)量即13個(gè)ANK基因。通過對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，ANK25基因不僅僅含有ANK結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還含有一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ANK25主要定位在細(xì)胞膜上。通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ANK25在干旱、鹽和ABA脅迫下均有響應(yīng)。