轉(zhuǎn)錄因子FOXA2生物素標(biāo)記體系構(gòu)建及其互作蛋白鑒定.pdf

1、乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。乳腺癌作為威脅女性健康最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在中國上升趨勢明顯。乳腺癌細(xì)胞的生長特性是:能無限生長、具有轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移能力。因此通過對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以期為腫瘤治療方案及臨床耐藥提供新的靶點(diǎn)。
　　生物素Avi-tag技術(shù)是指在目的蛋白的N端或C端加上由15個氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)組成的受體肽小標(biāo)簽，該小標(biāo)簽可被生物素連接酶BirA特異性識別，并

2、且生物素連接酶可催化生物素轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)蛋白標(biāo)簽上的賴氨酸殘基上，導(dǎo)致帶有標(biāo)簽的靶標(biāo)蛋白在體內(nèi)能被生物素化。該生物素化過程為酶促反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，標(biāo)記特異性強(qiáng)、專一性高，同時由于序列短小，僅僅只有15個氨基酸，對靶標(biāo)蛋白的構(gòu)象及活性影響極低。鏈霉親和素可以特異性地與生物素結(jié)合，結(jié)合力強(qiáng)。因此，可在嚴(yán)格的洗脫條件下分離出目標(biāo)蛋白及與其蛋白特異性相互作用的復(fù)合體。
　　叉頭框(Forkhead box)家族蛋白被發(fā)現(xiàn)大量的存在于真菌及動

3、物體內(nèi)，這個家族的主要特征是作為轉(zhuǎn)錄因子作用于DNA結(jié)合序列，于其DNA結(jié)合區(qū)域序列的極端保守性，并且在這類家族蛋白的尾部具有特殊的翼狀螺旋結(jié)構(gòu)。FOXA2是Forkhead box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，F(xiàn)OXA2參與胚胎發(fā)育，同時抑制多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并在參與細(xì)胞干性維持發(fā)揮重要作用。臨床上發(fā)現(xiàn)，在眾多腫瘤樣品如乳腺癌、肺癌等中發(fā)現(xiàn)FOXA2有較高水平的表達(dá)，F(xiàn)OXA2高表達(dá)或許與細(xì)胞的癌變有著密切的關(guān)聯(lián)。此外，F(xiàn)OXA2還參與多

4、種信號通路，包括調(diào)控致癌信號多種途徑。這些都暗示轉(zhuǎn)錄因子FOXA2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。
　　蛋白互作研究是后基因組時代一個重要研究內(nèi)容，也是當(dāng)前非常熱門研究領(lǐng)域。生物體內(nèi)，與外界進(jìn)行信號交換，都是通過配體與細(xì)胞表面的跨膜受體結(jié)合，而后通過蛋白-蛋白相互作用層層傳遞至細(xì)胞核中引起特定的生理生化反應(yīng)。生物機(jī)體內(nèi)每一個小分子都不是獨(dú)立存在的，而是通過與其它物質(zhì)結(jié)合協(xié)同發(fā)揮作用，從而形成一個相互交叉緊密聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)?？刂瓢┌Y也

5、不能只抑制單一的信號通路，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是由多條不同信號通路共同參與、相互影響、相互作用的最終結(jié)果。通過以FOXA2為核心、尋找其互作蛋白，分析信號通路調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，對于全面認(rèn)識FOXA2在細(xì)胞中的生物學(xué)功能，具有十分重要的價值。
　　本課題構(gòu)建了基于生物素Avi-tag的FOXA2真核表達(dá)載體，利用生物素與鏈霉親和素的高特異性、高親和力的結(jié)合性質(zhì)對FOXA2蛋白進(jìn)行純化，將所得的蛋白復(fù)合體進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，質(zhì)譜分析，然后通過生物

6、信息學(xué)進(jìn)行對比分析，尋找FOXA2可能存在的互作蛋白，然后通過免疫共沉淀等分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，我們在研究中尋找到了FOXA2的互作蛋白FOXP2，并且通過臨床樣品的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)FOXA2與FOXP2表達(dá)水平具有相關(guān)聯(lián)性。本研究主要包括兩點(diǎn):1.建立了轉(zhuǎn)錄因子FOXA2生物素標(biāo)記體系，實(shí)現(xiàn)了FOXA2在乳腺癌細(xì)胞中被生物素化，同時實(shí)現(xiàn)了且該蛋白Western Blotting、Pull-down等實(shí)驗(yàn)中無需抗體的一步法應(yīng)用，快速，經(jīng)