調(diào)控肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子FOXA2表達(dá)影響肝纖維化進(jìn)程.pdf

1、目的:
　　在本研究中我們首先通過(guò)檢測(cè)人肝硬化組織中FOXA2的表達(dá)水平，以及CCl4模型小鼠不同程度肝纖維化的肝組織、肝細(xì)胞和HSCs中FOXA2表達(dá)變化，探索FOXA2表達(dá)與肝纖維化的相關(guān)性;利用不同載體上調(diào)肝臟、肝細(xì)胞和HSCs的FOXA2表達(dá)水平，檢測(cè)對(duì)肝纖維化的作用;利用特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2小鼠觀察對(duì)肝纖維化的影響;最后通過(guò)基因芯片篩選差異基因，明確FOXA2對(duì)肝細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，初步闡述調(diào)控肝細(xì)胞FOXA2表

2、達(dá)影響肝纖維化的分子機(jī)制，為臨床治療肝纖維化提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　方法:
　　一、檢測(cè)FOXA2在肝纖維化中的表達(dá)特點(diǎn)
　　1、利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常人和肝硬化患者肝組織中FOXA2表達(dá)差異。
　　2、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CCl4模型不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟FOXA2表達(dá)變化。
　　3、利用Real-time RT-PCR和Western bl

3、ot法檢測(cè)正常小鼠與CCl4模型小鼠肝細(xì)胞中FOXA2表達(dá)差異。
　　4、利用Real-time RT-PCR和Western blot法檢測(cè)CCl4模型不同時(shí)間點(diǎn)小鼠HSCs中FOXA2表達(dá)變化。
　　二、上調(diào)肝臟FOXA2表達(dá)對(duì)肝纖維化的作用
　　1、通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP構(gòu)建FOXA2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCDH-FOXA2，利用包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒LV-

4、FOXA2，鑒定后通過(guò)尾靜脈注射至CCl4模型小鼠。
　　2、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫組化法檢測(cè)FOXA2組小鼠與對(duì)照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達(dá)變化。
　　3、使用H&E和天狼星紅染色法評(píng)估各組小鼠肝臟病理學(xué)變化，并使用軟件進(jìn)行膠原定量。
　　4、利用羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)各組小鼠肝臟中羥脯氨酸含量。
　　5、利用Real-time RT-PCR法

5、檢測(cè)各組小鼠肝組織炎癥指標(biāo)IL-6、TNF-α和TGF-β1的表達(dá)變化。
　　三、上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)對(duì)肝纖維化的影響
　　1、通過(guò)腺相關(guān)病毒載體pENN.AAV.TBG.PI.RBG構(gòu)建可特異性上調(diào)肝細(xì)胞的FOXA2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pAAV8-TBG-FOXA2，包裝為腺相關(guān)病毒后，通過(guò)尾靜脈注射至CCl4模型小鼠。
　　2、經(jīng)尾靜脈分別注射AAV8-TBG-FOXA2和對(duì)照病毒至正常小鼠，分離小鼠原代肝細(xì)胞和其他細(xì)胞

6、，利用Real-time RT-PCR和Western blot法鑒定腺相關(guān)病毒AAV8-TBG-FOXA2的特異性。
　　3、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫組化法檢測(cè)FOXA2組小鼠與對(duì)照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達(dá)變化。
　　4、使用H&E和天狼星紅染色法評(píng)估各組小鼠肝臟病理學(xué)變化，并使用軟件進(jìn)行膠原定量。
　　5、利用羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)各組小鼠肝臟中羥

7、脯氨酸含量。
　　6、利用Real-time RT-PCR和免疫組織化學(xué)法法檢測(cè)各組小鼠肝組織炎癥指標(biāo)IL-6、TNF-α和TGF-β1的表達(dá)變化。
　　四、敲除肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)對(duì)肝纖維化的影響
　　1、通過(guò)對(duì)FOXA2loxp小鼠進(jìn)行雜交、繁殖并鑒定出純合子FOXA2loxP/loxP小鼠，利用AAV-TBG-Cre特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2，并進(jìn)行CCl4造模。
　　2、利用Real-time RT-PC

8、R、Western blot和免疫組化法檢測(cè)FOXA2敲除組小鼠與對(duì)照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達(dá)變化。
　　3、使用H&E和天狼星紅染色法評(píng)估各組小鼠肝臟病理學(xué)變化，并利用軟件進(jìn)行膠原定量。
　　4、利用羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)各組小鼠肝臟中羥脯氨酸含量。
　　五、上調(diào)HSCs中FOXA2表達(dá)對(duì)肝纖維化的作用
　　1、通過(guò)慢病毒載體pLVX-GFAP-IRES-ZsGreen構(gòu)建可特異性上調(diào)星

9、狀細(xì)胞的FOXA2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLVX-GFAP-FOXA2，包裝為慢病毒并濃縮純化后，通過(guò)尾靜脈注射至正常小鼠，一周后注射CCl4復(fù)制肝纖維化模型。
　　2、分離已注射慢病毒LVX-GFAP-FOXA2的正常小鼠的原代肝細(xì)胞和HSCs，利用Real-time RT-PCR法鑒定慢病毒LVX-GFAP-FOXA2的特異性。
　　3、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫熒光法檢測(cè)FOXA2組小鼠與

10、對(duì)照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達(dá)變化。
　　4、使用H&E和天狼星紅染色法評(píng)估各組小鼠肝臟病理學(xué)變化。
　　六、上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)對(duì)CCl4模型小鼠肝細(xì)胞表達(dá)譜的影響
　　1、利用可特異性上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2的腺相關(guān)病毒AAV8-TBG-FOXA2經(jīng)尾靜脈注射至CCl4模型小鼠，分離小鼠原代肝細(xì)胞后抽提細(xì)胞總RNA，鑒定后進(jìn)行基因芯片雜交實(shí)驗(yàn)。
　　2、利用DAVID Online

11、Tools Suite網(wǎng)站工具，查詢The Gene Ontology(GO)、KEGG、BIOCARTA、BBID等數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取基因功能分類信息及歸屬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信息。
　　七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)以X± SD表示，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05有顯著差異，P＜0.01有非常顯著差異。
　　結(jié)果:
　　一、FOXA2表達(dá)與肝纖維化進(jìn)程成負(fù)相關(guān)
　　二、非特異性上調(diào)肝臟FOXA2可改

12、善肝纖維化
　　三、特異性上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2可改善肝纖維化
　　四、特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2可促進(jìn)肝纖維化
　　五、特異性上調(diào)星狀細(xì)胞FOXA2對(duì)肝纖維化無(wú)影響
　　六、上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)影響CCl4模型小鼠肝細(xì)胞基因表達(dá)
　　結(jié)論:
　　1、FOXA2在肝纖維化組織及肝細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而在HSCs中表達(dá)上調(diào)。
　　2、過(guò)表達(dá)肝臟FOXA2可改善小鼠肝纖維化。
　　3、特異性敲除