轉(zhuǎn)錄因子RUNX1調(diào)控腎臟炎癥及纖維化研究.pdf

1、背景與目的：慢性腎臟病常伴隨炎癥和纖維化病變，而炎癥貫穿于腎纖維化全過程。腎小管上皮細(xì)胞及其間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）以及巨噬細(xì)胞是腎臟炎癥和纖維化形成的重要機(jī)制。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)分化形式表達(dá)天然免疫分子DC-SIGN，參與腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化形成。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可通過表達(dá)DC-SIGN并與TLR4相互作用，參與腎臟局部炎癥調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子RUNX1是造血干細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子。我們前期研究發(fā)現(xiàn)RUNX1可能參

2、與TGF-β誘導(dǎo)的EMT調(diào)控，基于炎癥與纖維化的緊密關(guān)系，推測其可能也參與腎臟炎癥和纖維化形成。為此本研究在前期工作基礎(chǔ)上，擬從腎臟炎癥和纖維化兩個(gè)層面并以上述細(xì)胞為研究對象，探討RUNX1對巨噬細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞參與腎臟炎癥和纖維化病變中的調(diào)控作用，以及可能涉及的分子機(jī)制。
　　方法：（1）利用人單核巨噬細(xì)胞系THP-1、小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7以及小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞（PEM），分別給予LPS（100 ng/mL或10

3、00 ng/mL）刺激，采用RT-qPCR及Western blot檢測RUNX1的mRNA及蛋白表達(dá)水平；繼而利用siRNA技術(shù)干擾RUNX1的表達(dá)，PEM細(xì)胞經(jīng)LPS刺激并采用RT-qPCR和ELISA，檢測炎癥因子 IL-1β、IL-6及 TNF-α的分泌變化；隨后利用 RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)RUNX1穩(wěn)轉(zhuǎn)株，經(jīng)LPS刺激并采用RT-qPCR及ELISA，檢測炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌變化；進(jìn)一步利用R

4、UNX1抑制劑（Ro5-3335）干預(yù)，采用RT-qPCR和ELISA檢測上述炎癥因子分泌變化。（2）利用siRNA技術(shù)干擾RUNX1表達(dá)，PEM細(xì)胞經(jīng)LPS刺激并采用Western blot，檢測JNK、ERK、p38及p65的磷酸化水平以及IκBα降解狀況；繼而利用RUNX1抑制劑（Ro5-3335）干預(yù)，采用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)，檢測RUNX1及其不同截短體（1-242aa、50-178aa、243-453aa）對p50、p65

5、及p105誘導(dǎo)NF-κB熒光素酶活性的影響；隨后采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，分別檢測p50、p65及p105與 RUNX1結(jié)合狀況。（3）進(jìn)一步利用上述RUNX1抑制劑干預(yù)，體內(nèi)觀察對 LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克模型小鼠生存狀況以及炎癥因子 IL-1β、IL-6及TNF-α分泌的影響。（4）利用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）和大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，分別給予EMT誘導(dǎo)因子TGF-β刺激，采用RT-qPCR及Western blot，檢測上述腎

6、小管上皮細(xì)胞RUNX1的mRNA及蛋白表達(dá)水平；繼而利用siRNA技術(shù)干擾RUNX1表達(dá)，HK-2細(xì)胞經(jīng)TGF-β刺激，采用光學(xué)顯微鏡觀察EMT中細(xì)胞形態(tài)變化；此外利用HK-2細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)RUNX1穩(wěn)轉(zhuǎn)株，結(jié)合siRNA干擾技術(shù)，采用RT-qPCR檢測EMT標(biāo)志物Snai2、Vimentin表達(dá)；隨后利用上述人和大鼠腎小管上皮細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)RUNX1穩(wěn)轉(zhuǎn)株，采用RT-qPCR及Western blot，檢測上述標(biāo)志物Snail、Sna

7、i2、Vimentin、α-SMA表達(dá)。（5）進(jìn)一步利用建立單側(cè)輸尿管梗阻纖維化小鼠模型（UUO），采用RT-qPCR檢測腎組織中RUNX1、TGF-β、Snail、Snail2、Vimentin、Col1a1、Fibronectin等表達(dá)變化。
　　結(jié)果：（1）RUNX1可在巨噬細(xì)胞中組成性表達(dá)，而LPS可下調(diào)其表達(dá)；上調(diào)或下調(diào)巨噬細(xì)胞RUNX1表達(dá)，則可明顯促進(jìn)或抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β及IL-6分泌。（2）此外發(fā)現(xiàn)

8、 RUNX1不影響 TLR4下游信號通路的JNK、ERK、p38、p65磷酸化水平以及IκBα的降解，但其可明顯增強(qiáng)p50、p65和p105誘導(dǎo)的NF-κB活力，上述效應(yīng)可被RUNX1抑制劑予以抑制。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RUNX1可與p50相互結(jié)合。（3）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一表明，利用RUNX1抑制劑干預(yù)，則可抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素性休克模型小鼠腎內(nèi)炎癥因子IL-6分泌，減輕小鼠腎臟炎癥并改善其生存狀況。（4）另一方面，RUNX1可在促纖維化因子TGF-

9、β誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中明顯表達(dá)；上調(diào)或下調(diào)RUNX1表達(dá)，則可顯著促進(jìn)或抑制TGF-β誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變以及EMT標(biāo)志物Snai2及Vimentin的表達(dá)。（5）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，伴隨 RUNX1在纖維化小鼠模型腎組織中明顯表達(dá)，EMT及纖維化指標(biāo) Snail、fibronectin、Col1a1、CCL2及TGF-β均顯著上調(diào)，且小鼠腎纖維化程度明顯加重。
　　結(jié)論：RUNX1可通過調(diào)控 NF-κB信號通