miR-18a通過調(diào)控RUNX1基因表達影響血腫瘤屏障功能的機制研究.pdf

1、前言：
　　惡性腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，主要治療方法是手術與放化療。化療已成為惡性腦膠質(zhì)瘤的重要治療手段之一，而血腫瘤屏障的存在是限制大分子化療藥物進入腫瘤組織發(fā)揮化療療效的關鍵。
　　Mirco RNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細胞內(nèi)具有多種重要調(diào)節(jié)作用，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。每個miRNA都有多個靶基因，多個miRNA也可同時調(diào)節(jié)一個靶基因，從而參與生命過程

2、中的一系列重要進程，例如早期發(fā)育，細胞增殖、分化、凋亡、死亡等。近期有研究報道，miR-18家族成員(miR-17,miR-18a，miR-19a/b，miR-20a和miR-92a)參與細胞周期、分化、凋亡等調(diào)控，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-18a屬于miR17～92多順反子家族成員，目前對miR-17、miR-20和miR-92a的報道較多，而對miR-18a的報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細

3、胞凋亡等作用[25]-[26]。在參與調(diào)節(jié)血管生成方面的研究中，發(fā)現(xiàn)部分miR-17-92家族成員在利用體外正常內(nèi)皮細胞血管生成模型以及缺血或梗死的動物模型的研究中顯示出抑制血管生成的作用[11][14]。過表達miR-18a能夠抑制結(jié)腸癌的生長和結(jié)腸癌組織中的血管生成，過表達miR-18a可能成為結(jié)腸癌治療的新方法[27]。但是有關miR-18a表達與血腦屏障通透性改變之間的關系及其作用機制尚未見報道。
　　RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族

4、有3個成員，RUNX1，RUNX2和RUNX3。三者在人體發(fā)育過程中顯示出各自獨特的功能，如RUNX1基因是人類白血病中多個染色體易位的常見靶位點，它的突變可引起急性髓細胞性白血病;RUNX2是骨生成過程中的必需;RUNX3基因突變可能與胃癌的發(fā)生相關。近期對RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族的研究顯示，RUNX基因?qū)Σ煌谢蛴屑せ罨蛞种妻D(zhuǎn)錄的作用，其異常可誘發(fā)腫瘤[3]。RUNX1基因，亦稱作急性髓性白血病1(AML-1)，位于人類染色體21q2

5、2.3，由12個外顯子組成，全長大于260kb[24]。它在正常造血、惡性造血、細胞分化等過程中均發(fā)揮重要作用。大量造血相關基因作為RUNX1的靶基因，RUNX1與相關靶基因的啟動子結(jié)合后，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明，RUNX1還具有調(diào)控T細胞的功能，從而與自身免疫病相關[4]。在對RUNX1的靶基因的研究中發(fā)現(xiàn)，RUNX1作為轉(zhuǎn)錄激活因子可招募其它轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄激活復合物。RUNX1不僅在血液系統(tǒng)中有十分重要的轉(zhuǎn)錄激活作用，同時在

6、其他系統(tǒng)中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX1可與前列腺素相結(jié)合，參與排卵的調(diào)控。研究還發(fā)現(xiàn)，RUNX1可上調(diào)靶基因lagals3，參與人類垂體瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。但是RUNX1是否參與miR-18a調(diào)控血腫瘤屏障通透性，尚未見報道。
　　本研究中，應用過表達miR-18a質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hCMEC/D3細胞，建立體外BTB模型;研究miR-18a過表達對BTB通透性的影響，進一步驗證miR-18a是否能通過調(diào)節(jié)RUNX1影響血

7、腫瘤屏障的通透性，并初步明確其可能的分子機制，為腦膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新途徑。
　　方法：
　　1、人腦微血管內(nèi)皮細胞系hCMEC/D3細胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U87細胞和人胚腎細胞系HEK293T細胞的培養(yǎng)。
　　2、miR-18a過表達或表達沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立。
　　3、體外BTB模型的建立。
　　4、RUNX1過表達質(zhì)粒和表達沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染正常腦微血管內(nèi)皮細胞和miR-18a過表

8、達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。
　　5、應用real-time PCR和western blot檢測miR-18a和RUNX1在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中的內(nèi)源性表達水平。
　　6、應用跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electric resistance，TEER)和辣根過氧化物酶horseradish peroxidase，HRP）滲出量評估體外BTB模型的通透性變化。
　　7、應用real-time PCR、West

9、eern blot和免疫熒光法檢測膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中RUNX1、緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA以及蛋白表達水平變化和分布。
　　8、應用雙熒光素酶報告基因分析miR-18a和RUNX1的直接作用。
　　9、應用染色質(zhì)免疫共沉淀分析RUNX1與緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的直接作用。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立過表達miR-18a的穩(wěn)

10、定轉(zhuǎn)染細胞系。
　　2、成功建立體外BTB模型，獲得膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞。
　　3、miR-18a在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中的表達較正常腦微血管內(nèi)皮細胞顯著降低。
　　4、RUNX1在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中的表達較正常腦微血管內(nèi)皮細胞顯著升高。
　　5、過表達miR-18a顯著增加BTB的通透性。
　　6、過表達miR-18a顯著下調(diào)RUNX1和緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的

11、表達，并改變其分布。
　　7、RUNX1是miR-18a的靶基因。
　　8、過表達miR-18a顯著下調(diào)RUNX1的表達，并改變其分布。
　　9、miR-18a和RUNX1反向共同調(diào)節(jié)BTB的通透性。
　　10、miR-18a和RUNX1反向共同調(diào)節(jié)緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達水平。
　　11、膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中RUNX1與緊密連接相關蛋白ZO-1、occludi

12、n和claudin-5的啟動子直接結(jié)合。
　　討論：
　　本研究證明，在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中miR-18a的表達水平顯著低于在正常腦微血管內(nèi)皮細胞中的表達。許多研究表明miR-18a參與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大多數(shù)報道表明，miR-18a在結(jié)腸癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌等癌癥中表達上調(diào)，因此miR-18a被認為是候選的促癌基因。然而，L.Venturini等人發(fā)現(xiàn)miR-17-92家族的其他成員在慢病毒轉(zhuǎn)化K562

13、克隆細胞中表達上調(diào)，miR-18a的表達卻并未改變，這一原因還未被澄清。Fox等人發(fā)現(xiàn)miR-18a在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中表達很少，這與我們的研究結(jié)果一致。miR-18a在不同腫瘤細胞以及不同組織中呈現(xiàn)不同的表達水平，在不同的微環(huán)境下，miR-18a在不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能起不同的作用。然而，miR-18a是否參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞功能并進一步調(diào)節(jié)BTB通透性仍不清楚。
　　為探討miR-18a對BTB通透性的影響，本研究

14、建立了過表達miR-18a的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，成功建立了體外BTB模型。分別應用TEER和HRP滲出量檢測BTB的完整性和通透性。結(jié)果顯示，過表達miR-18a破壞BTB的完整性，使它的通透性增加。緊密連接蛋白在血腦屏障的形成和維持中發(fā)揮重要作用。ZO-1、occludin、claudin-5都是緊密連接的重要組成部分。在本研究中real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示miR-18a過表達顯著下調(diào)ZO-1、occlu

15、din、claudin-5的mRNA和蛋白表達;熒光染色的結(jié)果與real-time PCR、Western blot檢測結(jié)果相一致。目前，我們已經(jīng)證明了miR-18a通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達改變BTB的通透性。
　　然而，miR-18a調(diào)節(jié)BTB通透性的可能分子機制仍不清楚。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，RUNX1被認為是一些miRNA的可能的下游靶點。據(jù)報道，miR-23a的過表達可誘導惡性淋

16、巴瘤中RUNX1表達下調(diào)，在胃癌組織中，miR-23a與RUNX1的表達呈顯著負相關。我們應用生物信息學軟件TargetScan預測到在RUNX1 mRNA的3'UTR有一個潛在的miR-18a結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示RUNX1是miR-18a的靶基因。同時，miR-18a過表達能夠顯著下調(diào)RUNX1的mRNA和蛋白表達。其他研究者的研究結(jié)果也支持我們的觀點。比如，在胃癌和淋巴癌中，miR-18a的表達上調(diào)，而RUNX1

17、的表達下調(diào)。為了更好地研究miR-18a與RUNX1對BTB通透性的作用關系，我們在hCMEC/D3細胞和過表達miR-18a的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中分別過表達或表達沉默RUNX1，然后建立體外BTB模型。結(jié)果顯示，miR-18a和RUNX1反向共同調(diào)節(jié)BTB的通透性和緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達。這進一步說明了過表達miR-18a能夠通過下調(diào)RUNX1，降低緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和cl

18、audin-5的表達，進而增加BTB的通透性。進一步的染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果表明，在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中，RUNX1可以與ZO-1、occludin和claudin-5啟動子區(qū)一個潛在結(jié)合位點(TGGGGT)相結(jié)合。我們知道，轉(zhuǎn)錄因子不但通過控制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物同時可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子本身。最近的一項研究顯示，RUNX1與它的突變體在與ETS-1，CBFβ或者FLI-1結(jié)合上協(xié)同激活PF4啟動子。有報道說明，RUNX1通過結(jié)合促血小板生成素

19、(TPO) recaptor/c-Mp1啟動子調(diào)節(jié)造血細胞的生成，隨后轉(zhuǎn)錄激活物或抑制物的聚集從而促進生血內(nèi)皮細胞向造血干細胞的轉(zhuǎn)變。RUNX1同樣可調(diào)節(jié)自身表達水平通過上調(diào)Smad6的表達使自己被蛋白酶降解。然而，RUNX1與緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的直接結(jié)合能否調(diào)節(jié)RUNX1的轉(zhuǎn)錄活性還需進一步探索。
　　本研究證明了miR-18a可能是BTB通透性的重要調(diào)節(jié)因子。過表達miR-18a通過

20、下調(diào)RUNX1，降低緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達，進而增加BTB的通透性。由此我們認為miR-18a和RUNX1可作為抗腫瘤藥物通過BTB的潛在靶點，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略。
　　結(jié)論：
　　1、miR-18a和RUNX1在正常腦微血管內(nèi)皮細胞及膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中的內(nèi)源性表達趨勢相反，miR-18a在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞中的表達較正常腦微血管內(nèi)皮細胞明顯降低，而RUNX1則明顯