基因內miR-135a-1-2自身轉錄調控機制的研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類大小約為22個核苷酸的內源性短非編碼RNA，廣泛存在于動植物體內，通常結合機體內靶mRNA3'非編碼區(qū)(3'UTR)從而抑制mRNA的翻譯進而對基因表達起負調控作用。根據(jù)miRNA在基因組上與其它轉錄單位的位置關系，miRNA可分為基因間miRNA（intergenic miRNAs）和基因內miRNA(intragenic miRNA)，而后者包括蛋白質編碼基因的外顯子或內含子miRNA。目前，盡管

2、在動物和植物中對miRNA功能研究已經(jīng)揭示的很清楚了，但對miRNA基因自身的轉錄了解仍十分有限，而對位于基因內的miRNA及其與宿主基因的轉錄關系，更是知之甚少。本實驗室前期對miR-135a在脂肪生成的作用和功能進行了探索研究，但miR-135a在脂肪生成過程中的本身轉錄機制并不清楚。因此，本研究采用生物信息學預測、啟動子雙熒光素酶報告基因載體、點突變、EMSA、ChIP、ChIP-qPCR、q-PCR和western blot等實

3、驗技術對miR-135a-1/2的轉錄機制進行了研究，主要研究結果如下:
　　1.miR-135a-1與miR-135a-2位于宿主基因內
　　根據(jù)NCBI網(wǎng)站比對發(fā)現(xiàn)，mmu-miR-135a-1位于Chr9上Glyctk基因的第4或第5個外顯子區(qū)，mmu-miR-135a-2位于Chr10上Rmst基因的第12個內含子區(qū)。由此表明miR-135a-1和miR-135a-2都是基因內miRNA。
　　2.基因內miR

4、-135a-1和miR-135a-2獨立轉錄
　　采用了生物信息學預測miR-135a-1/2上游潛在的啟動子，進而利用分段缺失構建啟動子雙熒光素酶報告基因載體，瞬時轉染到3T3-L1、C3H10T1/2和BHK三種細胞中，根據(jù)雙熒光素酶活性檢測確定核心啟動子片段。再用相應的生物學網(wǎng)站預測此片段中潛在的轉錄因子，構建點突變質粒，轉染到3T3-L1細胞中，鑒定是否為核心轉錄因子，進而用EMSA和ChIP試驗驗證轉錄因子與啟動子是否結

5、合。試驗結果表明，miR-135a-1上游(-1128～-557 bp)和miR-135a-2上游(-2264～-1733bp)分別為核心啟動子區(qū)，并且轉錄因子STAT5a同時結合在此核心啟動子區(qū)域內。同時，點突變、EMSA和ChIP試驗結果得出STAT5a在細胞體外體內與核心啟動子結合。試驗證實，miR-135a-1/2并不隨著各自的宿主基因轉錄，而是具有自身的獨立轉錄本。
　　3.成脂轉錄因子STAT5a上調miR-135a表

6、達
　　構建STAT5a的超表達質粒，瞬時轉染到3T3-L1細胞中，檢測miR-135a及其靶基因APC的表達量。試驗結果表明，超表達STAT5a后，miR-135a的表達量上調，APC在mRNA水平上升但在蛋白水平下降。而干涉STAT5a后，miR-135a的表達量下降，APC在mRNA水平和蛋白水平上升。試驗表明，STAT5a上調miR-135a的表達。
　　4.轉錄因子STAT5a與miR-135a的靶基因APC存在一

7、個潛在的負反饋調節(jié)環(huán)路
　　為了探索轉錄因子STAT5a與miR-135a的靶基因APC之間的關系，本研究在超表達STAT5a的基礎上，誘導3T3-L1前脂肪細胞成脂肪細胞的過程中，檢測STAT5a和APC的表達情況。試驗結果得出，STAT5a和APC在mRNA水平和蛋白水平都呈現(xiàn)出此消彼長的趨勢，而miR-135a的表達與之前對miR-135a的功能研究結果一樣都是隨著脂肪細胞誘導加深表達量一直下降的。試驗結果顯示，在脂肪沉積過