基因內(nèi)miR-135a-1-2自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類大小約為22個核苷酸的內(nèi)源性短非編碼RNA，廣泛存在于動植物體內(nèi)，通常結(jié)合機(jī)體內(nèi)靶mRNA3'非編碼區(qū)(3'UTR)從而抑制mRNA的翻譯進(jìn)而對基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。根據(jù)miRNA在基因組上與其它轉(zhuǎn)錄單位的位置關(guān)系，miRNA可分為基因間miRNA（intergenic miRNAs）和基因內(nèi)miRNA(intragenic miRNA)，而后者包括蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子或內(nèi)含子miRNA。目前，盡管

2、在動物和植物中對miRNA功能研究已經(jīng)揭示的很清楚了，但對miRNA基因自身的轉(zhuǎn)錄了解仍十分有限，而對位于基因內(nèi)的miRNA及其與宿主基因的轉(zhuǎn)錄關(guān)系，更是知之甚少。本實驗室前期對miR-135a在脂肪生成的作用和功能進(jìn)行了探索研究，但miR-135a在脂肪生成過程中的本身轉(zhuǎn)錄機(jī)制并不清楚。因此，本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測、啟動子雙熒光素酶報告基因載體、點(diǎn)突變、EMSA、ChIP、ChIP-qPCR、q-PCR和western blot等實

3、驗技術(shù)對miR-135a-1/2的轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)果如下:
　　1.miR-135a-1與miR-135a-2位于宿主基因內(nèi)
　　根據(jù)NCBI網(wǎng)站比對發(fā)現(xiàn)，mmu-miR-135a-1位于Chr9上Glyctk基因的第4或第5個外顯子區(qū)，mmu-miR-135a-2位于Chr10上Rmst基因的第12個內(nèi)含子區(qū)。由此表明miR-135a-1和miR-135a-2都是基因內(nèi)miRNA。
　　2.基因內(nèi)miR

4、-135a-1和miR-135a-2獨(dú)立轉(zhuǎn)錄
　　采用了生物信息學(xué)預(yù)測miR-135a-1/2上游潛在的啟動子，進(jìn)而利用分段缺失構(gòu)建啟動子雙熒光素酶報告基因載體，瞬時轉(zhuǎn)染到3T3-L1、C3H10T1/2和BHK三種細(xì)胞中，根據(jù)雙熒光素酶活性檢測確定核心啟動子片段。再用相應(yīng)的生物學(xué)網(wǎng)站預(yù)測此片段中潛在的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞中，鑒定是否為核心轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而用EMSA和ChIP試驗驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子是否結(jié)

5、合。試驗結(jié)果表明，miR-135a-1上游(-1128～-557 bp)和miR-135a-2上游(-2264～-1733bp)分別為核心啟動子區(qū)，并且轉(zhuǎn)錄因子STAT5a同時結(jié)合在此核心啟動子區(qū)域內(nèi)。同時，點(diǎn)突變、EMSA和ChIP試驗結(jié)果得出STAT5a在細(xì)胞體外體內(nèi)與核心啟動子結(jié)合。試驗證實，miR-135a-1/2并不隨著各自的宿主基因轉(zhuǎn)錄，而是具有自身的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本。
　　3.成脂轉(zhuǎn)錄因子STAT5a上調(diào)miR-135a表

6、達(dá)
　　構(gòu)建STAT5a的超表達(dá)質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞中，檢測miR-135a及其靶基因APC的表達(dá)量。試驗結(jié)果表明，超表達(dá)STAT5a后，miR-135a的表達(dá)量上調(diào)，APC在mRNA水平上升但在蛋白水平下降。而干涉STAT5a后，miR-135a的表達(dá)量下降，APC在mRNA水平和蛋白水平上升。試驗表明，STAT5a上調(diào)miR-135a的表達(dá)。
　　4.轉(zhuǎn)錄因子STAT5a與miR-135a的靶基因APC存在一

7、個潛在的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路
　　為了探索轉(zhuǎn)錄因子STAT5a與miR-135a的靶基因APC之間的關(guān)系，本研究在超表達(dá)STAT5a的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂肪細(xì)胞的過程中，檢測STAT5a和APC的表達(dá)情況。試驗結(jié)果得出，STAT5a和APC在mRNA水平和蛋白水平都呈現(xiàn)出此消彼長的趨勢，而miR-135a的表達(dá)與之前對miR-135a的功能研究結(jié)果一樣都是隨著脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)加深表達(dá)量一直下降的。試驗結(jié)果顯示，在脂肪沉積過