豬ROCK1和ROCK2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、豬肉是人類獲取動(dòng)物蛋白的重要來源，備受研究者關(guān)注。同時(shí)，基于豬在生理、解剖、病理、基因組等與人的相似性，可以作為研究肥胖、肌肉萎縮、糖尿病、高血壓等人類健康相關(guān)疾病的模型。因此，對與肌肉生長發(fā)育相關(guān)基因的研究對于肉質(zhì)的生產(chǎn)、提高和人類健康相關(guān)的醫(yī)學(xué)都具有重要意義。
　　我們把在大白和梅山豬胚胎期65天、出生后3天、60天、120天等四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的背最長肌中的差異表達(dá)，參與多種基本生命活動(dòng)調(diào)節(jié)的ROCK基因確定為候選基因，對其進(jìn)

2、行功能和調(diào)控機(jī)制的研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用定量PCR的方法，用PPIA、HPRT和eEF-1γ作為內(nèi)參基因分別檢測了2月齡大白豬不同組織中ROCK1，ROCK2基因的表達(dá)情況。
　　2、構(gòu)建了豬ROCK1，ROCK2基因啟動(dòng)子系列缺失的雙熒光報(bào)告載體ROCK1-P0-P11，ROCK2-1F-7F分別轉(zhuǎn)染PK和C2C12細(xì)胞系。熒光活性檢測發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞系中活性趨勢類似。根據(jù)ROCK1各個(gè)缺失片段雙熒光活性的變

3、化，推斷-744/-402 bp是ROCK1基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域;ROCK2中，對熒光活性影響較大的片段進(jìn)行分析后，推斷ROCK1-7-F(+37-+175bp)區(qū)域?qū)OCK2基因的啟動(dòng)子活性發(fā)揮重要作用。
　　3、對ROCK1-P5區(qū)域內(nèi)潛在的Sp1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后，熒光活性顯著下降(p＜0.05); ROCK1-P5分別與不同量的Sp1真核過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)Sp1可以促進(jìn)ROCK1-P5活性，這種促進(jìn)作用轉(zhuǎn)染Sp1

4、的量存在正相關(guān)性。EMSA、DNApull down共同驗(yàn)證了Sp1蛋白可以與ROCK1核心啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)三個(gè)Sp1結(jié)合體外位點(diǎn)，并且各位點(diǎn)的結(jié)合能力存在著差異。ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Sp1，而非Sp3，與豬ROCK1啟動(dòng)子的體內(nèi)結(jié)合。
　　4、在PK和C3H10T1/2中，共轉(zhuǎn)染C/EBPα真核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)ROCK2-2B-F，3-F，4-F，7-F片段的活性顯著升高，將這些序列細(xì)化缺失，進(jìn)行熒光活性測定，發(fā)現(xiàn)PK細(xì)胞中，ROCK2

5、-2B-F/5F這段區(qū)域活性極低，推測ROCK2-7-F區(qū)域?yàn)楹诵膯?dòng)子。ROCK2-7-F中C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變后熒光活性顯下降。隨后應(yīng)用EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明C/EBPα蛋白能與啟動(dòng)子上C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)體外結(jié)合。
　　5、過表達(dá)Sp1時(shí)，ROCK1啟動(dòng)子活性升高，而抑制時(shí)則下降;熒光定量PCR和western blot結(jié)果顯示，Sp1促進(jìn)ROCK1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá);同時(shí)，Sp1過表達(dá)后Myod，Myog，My

6、HC在mRNA水平的表達(dá)上升。而C/EBPα過表達(dá)，促進(jìn)ROCK2轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)熒光定量PCR和western blot結(jié)果顯示，C/EBPα可以刺激ROCK2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　6、共轉(zhuǎn)染小鼠ROCK1基因3'UTR區(qū)域的熒光活性載體與人工合成的miRNA模擬片段，發(fā)現(xiàn)miR-33-5p，miR-376c-3p分別與ROCK1基因的3'UTR結(jié)合。轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNA對ROCK1轉(zhuǎn)錄水平的影響不明顯，而

7、對蛋白水平的影響比較顯著。
　　7、miR-142-3p在C2C12細(xì)胞分化過程中(2day、5day、8day)表達(dá)量不斷下降，而在增殖期(0day)表達(dá)量低于分化初期(2day)，高于分化末期(8day); ROCK2在分化時(shí)期(2day、5day、8day)表達(dá)量不斷升高，增殖期表達(dá)量最低。
　　8、共轉(zhuǎn)染小鼠ROCK2基因3'UTR區(qū)域的熒光活性載體與人工合成的miRNA，miRNA inhibitor模擬片段，發(fā)現(xiàn)