USF1下調(diào)結(jié)直腸癌中FHL2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、FHL2（four and a half LIM domain protein2）是一種多功能蛋白。不同的亞細(xì)胞器中FHL2可能參與不同的生物學(xué)過程。FHL2能夠與integrin、presenilin-2以及電壓門控K+通道受體相互作用，從而與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（包括ERK2、FAPp175和腺苷酸環(huán)化酶）發(fā)生相互作用，影響轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響基因表達(dá)。FHL2還可以調(diào)節(jié)剪接、DNA復(fù)制和修復(fù)過程。另外，F(xiàn)HL2可以與結(jié)構(gòu)

2、蛋白如β-actinin、肌動(dòng)蛋白和肌聯(lián)蛋白結(jié)合。 最初發(fā)現(xiàn)FHL2基因在肌原細(xì)胞中表達(dá)，但是在惡性橫紋肌肉瘤細(xì)胞中下調(diào)。后來的研究發(fā)現(xiàn)FHL2除了在骨骼肌和平滑肌中不表達(dá)，在腦、肝臟和肺中低表達(dá)之外，在其余組織中均表達(dá)，而且與腫瘤關(guān)系密切。在鱗癌、惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、髓系白血病、宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌和腎癌中FHL2的轉(zhuǎn)錄活性明顯增高，而在淋巴細(xì)胞白血病、Burkitt's中FHL2的轉(zhuǎn)錄活性極低甚至缺乏。肺癌標(biāo)本中F

3、HL2重度核染，而在正常肺組織中FHL2無表達(dá)，且高表達(dá)FHL2的非癌病人1年生存率明顯低于不表達(dá)FHL2的病人。與正常卵巢組織相比，在人卵巢癌的上皮細(xì)胞FHL2表達(dá)增高。與正常肝臟組織相比，10例肝癌標(biāo)本中8例標(biāo)本的FHL2mRNA表達(dá)水平明顯增高。 本課題組的前期工作已經(jīng)完成以下內(nèi)容：1、胃腸道腫瘤組織中FHL2的表達(dá)明顯高于配對(duì)的正常組織。反義FHL2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃結(jié)腸腫瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變長或者成為梭狀，胞漿變長或者成為樹枝狀

4、且核漿比例變小。反義FHL2可以誘導(dǎo)CEA、E-cadherin和F-actin的成熟，且抑制包括cox-2、survivin、c-jun和hTERT等癌基因的表達(dá)，抑制AP-1和hTERT的啟動(dòng)子活性。抑制FHL2可以抑制血清依賴、錨定依賴和非依賴的細(xì)胞生長，并且抑制裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中腫瘤的形成。因此抑制FHL2基因可以誘導(dǎo)胃腸道腫瘤細(xì)胞的分化并且抑制胃腸道腫瘤的形成； 2、免疫組化發(fā)現(xiàn)FHL2蛋白在結(jié)直腸癌組織中高度表達(dá)，但其表

5、達(dá)程度與癌癥病理分級(jí)無明顯相關(guān)；3、已經(jīng)成功制備并鑒定了兔抗人的FHL2多克隆抗體。 FHL2由4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域組成，其中半個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域位于N端，屬于LIM蛋白。人類FHL2基因定位在人染色體2q12-q14，由7個(gè)外顯子組成，其中前3個(gè)是非編碼序列。對(duì)該基因的啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子序列上存在著多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括p53、SRF、Nkx2.5、MEF-2、E2F、E-box、AP1等。盡管特定轉(zhuǎn)

6、錄因子的實(shí)際作用還未完全明確，但有證據(jù)支持p53、SRF、Nkx2.5、MEF-2、E2F、AP1等參與了FHL2基因的轉(zhuǎn)錄。雖然在FHL2啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)E-box位點(diǎn)，但至今尚無關(guān)于E-box位點(diǎn)介導(dǎo)FHL2轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制研究的報(bào)道。根據(jù)啟動(dòng)子序列預(yù)測軟件，我們推測USF1可能通過結(jié)合FHL2基因啟動(dòng)子上的E-box位點(diǎn)，從而調(diào)控FHL2基因的轉(zhuǎn)錄。 E-box位點(diǎn)是USF1、USF2、TFE3等多個(gè)bHLH-zip

7、（basic helix-loop-helix leucinezipper）轉(zhuǎn)錄因子家族成員的結(jié)合位點(diǎn)。1985年，Sawadogo等人首次從Hela細(xì)胞核內(nèi)提取物中部分純化出一種稱為USF（上游刺激因子，后來命名為USF1）的序列特異性轉(zhuǎn)錄因子，并在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入U(xiǎn)SF可以使腺病毒Major late promoter的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)10～20倍。隨后的研究證實(shí)了USF是進(jìn)化高度保守的bHLH-zip轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，能通過結(jié)合D

8、NA上的E-box位點(diǎn)（核心序列為5’CANNTG3’）發(fā)揮作用。 USF是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，其細(xì)胞特異性的表達(dá)是由于與之發(fā)生相互作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及其轉(zhuǎn)錄后激活和翻譯后修飾均具有細(xì)胞特異性。USF1具有類似于Myc蛋白的bHLH-LZ結(jié)構(gòu)，可競爭性結(jié)合相同的靶DNA序列，從而拮抗Myc促進(jìn)細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化的功能，為正常胚胎發(fā)育所必需。Hela細(xì)胞中過表達(dá)USF可引起生長抑制，然而由于Saos-2細(xì)胞缺乏USF的轉(zhuǎn)錄活性

9、，在該細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。6種乳腺癌細(xì)胞中3種USF轉(zhuǎn)錄活性缺失。USF轉(zhuǎn)錄活性在腫瘤細(xì)胞中缺失或者降低，這可能與E-box位點(diǎn)的突變或者甲基化修飾而終止蛋白質(zhì)-DNA的相互作用，以及翻譯后修飾和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用的改變，而抑制USF的轉(zhuǎn)錄活性，最終下調(diào)P53的表達(dá)。DNA損傷時(shí)，激活的USF1可通過調(diào)節(jié)P53和BRCA2基因參與DNA的修復(fù)。在永生化的腫瘤細(xì)胞中USF1通過與hTERT結(jié)合，參與腫瘤的進(jìn)程。 因此，我們

10、推測USF1可能通過結(jié)合FHL2基因啟動(dòng)子上的E-box位點(diǎn)，從而調(diào)控FHL2基因的轉(zhuǎn)錄。 研究目的： 探討USF1在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用及其對(duì)FHL2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用與機(jī)制。 研究內(nèi)容、方法： 一、利用RT-PCR和Western blot方法檢測不同的人胃腸道腫瘤細(xì)胞中USF1的表達(dá)情況； 一、利用免疫組化方法檢測不同分期的人結(jié)直腸腫瘤組織中USF1的表達(dá)情況； 三、利用EMSA和C

11、hIP方法檢測USF1蛋白與FHL2基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況； 四、利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建FHL2啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體，利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建FHL2啟動(dòng)子的突變載體； 五、利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測定點(diǎn)突變FHL2啟動(dòng)子的E-box位點(diǎn)后，突變載體熒光素酶活性的變化； 六、利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-USF1； 七、利用RT-PCR和Western blot方法檢測過表達(dá)或者干

12、擾USF1后FHL2的表達(dá)情況； 八、利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測過表達(dá)或者干擾USF1后FHL2啟動(dòng)子的熒光素酶活性。 結(jié)果： 一、USF1在不同的人胃腸道腫瘤細(xì)胞株中具有不同的表達(dá)水平 8株人胃腸道腫瘤細(xì)胞均表達(dá)USF1蛋白。USF1在蛋白水平的表達(dá)量以SW480、SW620和LoVo細(xì)胞最高，而在KATOⅢ細(xì)胞中的含量最低；USF1在mRNA水平的表達(dá)量以SW480、SW620、LoVo和HCT1

13、16細(xì)胞最高，而在KATOⅢ細(xì)胞中的含量最低。 二、USF1在人結(jié)直腸腫瘤組織的表達(dá)顯著增強(qiáng) USF1在人正常結(jié)直腸黏膜中蛋白呈低表達(dá)；在有不典型增生的人腺瘤組織中，USF1的表達(dá)相對(duì)于正常人結(jié)直腸黏膜開始增強(qiáng)；而在人結(jié)直腸癌組織中其表達(dá)顯著增強(qiáng)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0018）。USF1蛋白的表達(dá)在不同Dukes’分期、不同分化程度的結(jié)直腸癌組織之間無明顯差異（P>0.05）。 三、USF1對(duì)FHL2基因

14、的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用 1、USF1能夠與FHL2啟動(dòng)子的上游E-box位點(diǎn)特異性結(jié)合 EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SW480細(xì)胞的核蛋白與-817bp/-812bp處E-box位點(diǎn)結(jié)合形成了DNA-核蛋白復(fù)合物，且競爭性探針可以抑制此復(fù)合物的形成。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SW480細(xì)胞中USF1蛋白能與FHL2基因DNA結(jié)合。 2、定點(diǎn)突變FHL2啟動(dòng)子的E-box位點(diǎn)后，突變載體的熒光素酶活性較未突變組明顯升高 雙熒光

15、素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)在SW480細(xì)胞和LoVo細(xì)胞中4個(gè)FHL2基因啟動(dòng)子報(bào)告載體的轉(zhuǎn)錄活性不同，其中pluc595的熒光素酶活性值最高。 對(duì)FHL2啟動(dòng)子區(qū)域-817/-812bp處的E-box進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其由CAGCTG序列變?yōu)門AATTG，從而破壞E-box位點(diǎn)的序列，使其不能與USF1結(jié)合。定點(diǎn)突變FHL2啟動(dòng)子后，突變載體熒光素酶活性較未突變組明顯升高（p<0.05）。 3、構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+

16、）-USF1，并篩選出USF1高表達(dá)的SW480細(xì)胞和LoVo細(xì)胞，將其命名為SW480USF1和LoVoUSF1。 4、在SW480USF1和LoVoUSF1中，F(xiàn)HL2表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。 5、在SW480細(xì)胞和LoVo細(xì)胞中采用USF1 siRNA干擾USF1的表達(dá)后，F(xiàn)HL2表達(dá)水平顯著增高（P<0.05）。 6、在SW480USF1和LoVoUSF1中，F(xiàn)HL2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性下降。