人肝細(xì)胞癌中DEK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:DEK蛋白在多種人類侵襲性腫瘤中均出現(xiàn)過表達(dá)，目前已被確認(rèn)為是一種癌基因，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期研究結(jié)果顯示，DEK基因在人肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞，提示DEK可能在HCC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用;同時(shí)，DEK基因核心啟動(dòng)子序列(-167bp～+35bp)的甲基化水平在HCC細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞中存在顯著差異，且在HCC細(xì)胞系中普遍處于低甲基化狀態(tài)。

2、鑒于目前對(duì)DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究還比較少，因此本研究在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)DEK基因核心啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析和后續(xù)研究，以確定調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，從而揭示DEK基因在人肝細(xì)胞癌中過表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　方法:基于前期的工作基礎(chǔ)，本研究運(yùn)用在線軟件TFSEARCH對(duì)DEK啟動(dòng)子CpG島區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)合DNA甲基化差異分析，初步篩選出對(duì)DEK基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性起重要調(diào)

3、控作用的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)。之后，對(duì)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變和缺失突變來驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是維持DEK基因啟動(dòng)子活性的重要調(diào)控區(qū)。最后，利用siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的重要轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DEK基因啟動(dòng)子活性及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用以及與DEK啟動(dòng)子在HCC細(xì)胞系中的相互作用。
　　結(jié)果:雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，DEK截短啟動(dòng)子序列中緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的CpG2-2片段對(duì)D

4、EK啟動(dòng)子活性影響最大。進(jìn)一步，TFSEARCH預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpG2-2區(qū)域存在AP-2α等轉(zhuǎn)錄因子的特異結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合正常細(xì)胞與組織以及HCC細(xì)胞系中甲基化位點(diǎn)差異分析發(fā)現(xiàn)AP-2α結(jié)合位點(diǎn)的甲基化差異最大，因此我們預(yù)測(cè)AP-2α是調(diào)控DEK啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。之后，定點(diǎn)突變和缺失突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可明顯調(diào)控DEK核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性;進(jìn)一步的siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀