鼻咽癌HOX基因表達(dá)譜及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、同源異型基因HOX基因(Homeotic genes)屬于同源異形盒(Homeobox)家族一員，是一類進(jìn)化高度保守的轉(zhuǎn)錄因子。HOX基因通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控發(fā)育相關(guān)基因，控制組織和器官的形成。目前研究表明HOX基因表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，某些重大疾病如惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展也與HOX基因表達(dá)譜異常密切相關(guān)。
　　鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是一種在世界上大部分地區(qū)罕見但在中國南部以及東南亞地區(qū)

2、高發(fā)的惡性腫瘤，其主要的致病因素EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)編碼的潛伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein1，LMP1)是目前已被確證具有瘤基因功能的蛋白。我們以鼻咽癌細(xì)胞為模型，通過基因芯片和RT-PCR方法在細(xì)胞水平檢測了HOX基因表達(dá)譜，LMP1陽性鼻咽癌細(xì)胞系與陰性細(xì)胞系相比，部分HOX基因如HOXA5，HOXB3，HOXB13，HOXC8等比陰性細(xì)胞系異常低表達(dá)。隨后，我們又在2

3、3例鼻咽癌組織樣本中通過免疫組化方法在組織水平發(fā)現(xiàn)LMP1陽性組織中這些HOX基因同樣發(fā)生低表達(dá)趨勢，與細(xì)胞水平結(jié)果一致。我們進(jìn)一步采用報(bào)告基因分析法，證明了EBV LMP1可顯著抑制HOXB13和HOXC8啟動(dòng)子活性，并呈劑量依賴效應(yīng)。這些研究發(fā)現(xiàn)提示HOX基因可能為一類受EBVLMP1負(fù)性調(diào)節(jié)的靶基因。
　　HOX基因表達(dá)調(diào)控涉及多方面，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是最為直接有效的方式之一。真核生物基因通過RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymera

4、seⅡ，PolⅡ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA。新近研究表明，在人類基因組中50％的基因處于轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)，20％的基因處于沉默狀態(tài)（無PolⅡ結(jié)合），其余的基因同樣處于沉默狀態(tài)，但近端啟動(dòng)子區(qū)域卻有結(jié)合PolⅡ即處于PolⅡ Stalling狀態(tài)。采用ChIP法，我們通過檢測了HOXA5，HOXB3，HOXB13和HOXC8等基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcriptionstart site，TSS)區(qū)域PolⅡ富集程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMP1陽性鼻咽

5、癌細(xì)胞系中HOX基因的TSS區(qū)域同樣有PolⅡ的富集，表明這些HOX基因?yàn)镾talled基因，提示EBV LMP1可通過PolⅡ Stalling的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式調(diào)控HOX基因。
　　放射治療為目前鼻咽癌的主要治療方式。放射處理可誘發(fā)DNA損傷修復(fù)(DNA Damage Response，DDR)，令人感興趣的是，DDR可誘發(fā)一些靶基因發(fā)生DNA去甲基化。新近報(bào)道，5hmC直接參與DNA去甲基化過程，而DNA去甲基化與基因重新活化相

6、關(guān)。我們首先通過放射處理CNE1-LMP1細(xì)胞建立DNA損傷修復(fù)模型，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)放射處理可使LMP1失活的HOXA5，HOXB3，HOXB13和HOXC8等基因重新活化，其機(jī)制與這些HOX基因TSS區(qū)的Stalled PolⅡ重新釋放和5mC及5hmC甲基化水平降低等有關(guān)，并伴隨DNA去甲基化酶TET2表達(dá)水平增高。這些研究提示TET2和5hmC有可能參與DNA去甲基化，從而釋放Stalled PolⅡ，導(dǎo)致HOX基因的

7、重新活化。
　　我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在60種腫瘤細(xì)胞系(http://discover.nci.nih.gov/cellminer/analysis.do)中HOXA5, HOXB3,HOXB13，HOXC8與多種能量代謝基因具有顯著相關(guān)性，這提示我們HOX基因可能作為轉(zhuǎn)錄因子對腫瘤能量代謝具有重要作用，其中HOXC8與能量代謝相關(guān)基因最為密切。因此，我們以HOXC8為例研究其在鼻咽癌中的生物學(xué)功能。我們將外源性HOXC8導(dǎo)

8、入LMP1陽性鼻咽癌細(xì)胞系CNE1-LMP1，通過MTS方法發(fā)現(xiàn)HOXC8可顯著抑制其增值，通過臨床生化儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)乳酸形成和葡萄糖消耗均顯著降低，并發(fā)現(xiàn)HOXC8可顯著抑制HK2和GLUT1等糖酵解關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平，上調(diào)TIGAR糖酵解負(fù)性調(diào)控因子表達(dá)，表明HOXC8可能具有抑制糖酵解的作用。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)HOXC8可以促進(jìn)氧化磷酸化重要酶類SCO2的表達(dá)，提示與之密切相關(guān)的三羧酸循環(huán)可能得到增強(qiáng)。因此，我們進(jìn)一步

9、檢測了三羧酸循環(huán)中的一些重要酶類，例如2-羥基戊二酸脫氫酶(2-hydroxyglutaricacid dehydrogenase，2-HGDH)、琥珀酸脫氫酶復(fù)合物Ⅱ D(succinatedehydrogenase D，SDHD)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutaratedehydrogenase，α-KGDH)包括OGDH、DLST、DLD三種亞基、延胡索酸(fumarate hydratase，F(xiàn)H)以及順烏頭酸酶(a

10、conitase)包括ACO1和ACO2等，發(fā)現(xiàn)HOXC8均能顯著上調(diào)這些酶類的表達(dá)，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。這些研究進(jìn)一步表明HOXC8可能直接靶向三羧酸循環(huán)中的重要酶類。
　　本課題以鼻咽癌為模型，研究了HOX基因表達(dá)譜與鼻咽癌之間的內(nèi)在聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)HOX基因在EBV-LMP1陽性鼻咽癌中發(fā)生PolⅡStalling，表達(dá)受到顯著抑制。放射處理可誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)，其機(jī)制可能通過TET2和5hmC介導(dǎo)DNA去甲基化，影響Stall