人IRF-5基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患兒與健康兒童外周血中干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor5，IRF-5）、IFN-α及Sp1基因的差異表達(dá);克隆人IRF-5的啟動(dòng)子并尋找其核心啟動(dòng)子區(qū)域;鑒定調(diào)控IRF-5的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子;探索組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylaseinhibitors，HDACi)及組蛋

2、白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)對IRF-5表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　提取12例確診的SLE患兒及健康兒童的外周血單個(gè)核細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IRF-5、IFN-α及Sp1的表達(dá);采用PCR方法獲取IRF-5基因5'側(cè)翼序列及一系列5'端缺失體，定向插入到pGL3-Basic載體中，雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)鑒定其啟動(dòng)子活性;TFSEARCH在線軟件及JASPAR

3、 database預(yù)測IRF-5核心啟動(dòng)子區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，利用點(diǎn)突變技術(shù)、RNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecitation，ChIP)等實(shí)驗(yàn)，鑒定調(diào)控IRF-5的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子;觀察2種HDACi-曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)、丙戊酸鈉(valproic

4、acid，VPA)及2種HAT-P300、PCAF對IRF-5啟動(dòng)子活性、mRNA及蛋白表達(dá)的影響，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測TSA、VPA對受誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞上清液中IFN-α、TNF-α表達(dá)的影響，用ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)觀察TSA、VPA對Sp1、PolⅡ、HDAC3、P300及PCAF與IRF-5啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SLE患兒中IRF-5、Sp1及IFN-α的表達(dá)較健康兒童升高55％、61％及

5、85％，Sp1、IFN-α的表達(dá)與IRF-5呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　2.IRF-5一系列截短的質(zhì)粒螢光素酶活性分析顯示:從-1760 bp缺失到-179bp位后，仍具有較高的啟動(dòng)子活性，但從-179 bp位缺失到-40 bp位時(shí)，啟動(dòng)子活性顯著下降，提示IRF-5核心啟動(dòng)子位于-179～+62bp區(qū)域。
　　3.生物信息學(xué)預(yù)測該區(qū)域包含了3個(gè)Sp1的結(jié)合位點(diǎn)，點(diǎn)突變、RNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)、EMSA、ChIP及實(shí)

6、時(shí)熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)證明Sp1能與IRF-5的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并正向調(diào)控IRF-5的表達(dá)。
　　4.TSA、VPA下調(diào)IRF-5的表達(dá)并抑制受誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞上清液中IFN-α、TNF-α的釋放，P300下調(diào)IRF-5的表達(dá)，而PCAF對IRF-5的表達(dá)沒有影響，ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)TSA及VPA抑制Sp1、PolⅡ、HDAC3、P300與IRF-5啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，而對PCAF與IRF-5啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合沒有影響。

7、>　　結(jié)論:
　　1.SLE患兒中IRF-5、Sp1及IFN-α的表達(dá)高于健康兒童，Sp1、IFN-α的表達(dá)與IRF-5呈正相關(guān)，提示IRF-5可能參與兒童SLE的發(fā)病。
　　2.人IRF-5基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域位于-179至+62 bp處，Sp1能夠正向調(diào)控IRF-5的表達(dá)，從而為治療IRF-5基因相關(guān)的疾病提供靶點(diǎn)。
　　3.TSA、VPA下調(diào)IRF-5的表達(dá)，并抑制IFN-α、TNF-α的釋放，P300能下調(diào)IR