輻射誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞IER5基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一,全球每年新發(fā)肝癌的55％發(fā)生在我國,其年死亡率占我國惡性腫瘤死亡率的第三位,我國肝癌診治形式十分嚴(yán)峻;目前常用的肝癌非手術(shù)療法有:肝動(dòng)脈栓塞化療、瘤內(nèi)無水酒精注射、射頻消融等,療效均不理想。放療是惡性腫瘤治療的三大手段之一,近年來,隨著三維適形放療和調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)的發(fā)展,放療已成為肝癌治療的有力武器。腫瘤細(xì)胞對輻射的敏感性是影響腫瘤放療效果的關(guān)鍵問題之一,輻射敏感性受輻射誘導(dǎo)表達(dá)的基因調(diào)控,

2、尋找腫瘤的輻射敏感基因,闡明輻射對基因的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制及其與腫瘤輻射敏感性之間的關(guān)系,對提高腫瘤放療效果、延長腫瘤患者的生存期具有重要意義。
　　 IER-5是Immediate early response5的簡稱,屬于早期慢反應(yīng)基因家族,早期反應(yīng)基因的激活是細(xì)胞和染色體對外在刺激反應(yīng)最初和最重要的一步。研究顯示IER5基因存在于一些腫瘤和正常組織中,其表達(dá)變化會影響到細(xì)胞周期和凋亡。2005年,我們和Kis等人幾乎同時(shí)采用基因

3、芯片技術(shù)對一些基因進(jìn)行了輻射效應(yīng)篩查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻射后IER5基因表達(dá)上調(diào)。因此,我們開始關(guān)注該基因,先后利用基因沉默與過表達(dá)等技術(shù)對IER5基因的輻射效應(yīng)及其生物學(xué)功能進(jìn)行研究,還確定了IER5基因輻射應(yīng)答的啟動(dòng)子區(qū)域。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),輻射能誘導(dǎo)IER5基因mRNA水平表達(dá)上調(diào);該基因沉默(RNAi)能促進(jìn)細(xì)胞生長,且對輻射表現(xiàn)出拮抗性;該基因過表達(dá)能抑制細(xì)胞生長,并促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,生物信息學(xué)分析預(yù)測IER5基因啟動(dòng)子的最可能范圍為-

4、408bp到-238bp。這些實(shí)驗(yàn)均表明IER5基因是一種與癌癥放療有關(guān)的基因,在輻射情況下其生物學(xué)功能類似于抑癌基因。正因?yàn)槿绱?我們決定對IER5基因做深入探索,擬采用生物信息學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)等方法,利用HepG2細(xì)胞對IER5基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,旨在揭示IER5基因在肝癌放療中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,為今后臨床上肝癌放療增敏和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。以上研究結(jié)果提示我們IER5基因可能為肝癌輻射敏感基因,應(yīng)對其進(jìn)行更深入的研究。<

5、br>　　 目的:IER5屬于早期反應(yīng)基因,其作用類似于抑癌基因,輻射后出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前,國內(nèi)外對IER5基因的研究不多,檢索到的一些文獻(xiàn)大多是在闡述IER5的基因結(jié)構(gòu)信息與生物學(xué)功能。因此本研究的目的是通過分析轉(zhuǎn)錄因子對IER5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響,旨在揭示IER5基因在肝癌放療中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,為今后臨床上肝癌放療增敏和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 方法:首先,根據(jù)網(wǎng)址http://thr.cit.nih

6、.gov/molbio/proscan,對IER5基因啟動(dòng)子內(nèi)所含潛在順式作用元件的分析結(jié)果,構(gòu)建IER5基因的熒光素酶報(bào)告載體,利用啟動(dòng)子突變分析實(shí)驗(yàn)確定IER5基因啟動(dòng)子內(nèi)的順式作用元件的種類和分布。其次,在HepG2細(xì)胞系內(nèi),利用共轉(zhuǎn)染方法分析輻射前后轉(zhuǎn)錄因子對IER5基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響;利用EMSA方法分析轉(zhuǎn)錄因子GCF在體外是否與IER5基因啟動(dòng)子內(nèi)的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合以及輻射前后該轉(zhuǎn)錄因子與IER5基因啟動(dòng)子內(nèi)相應(yīng)結(jié)合位

7、點(diǎn)結(jié)合有無變化;采用CHIP方法確定轉(zhuǎn)錄因子GCF在體內(nèi)是否與IER5基因啟動(dòng)子內(nèi)的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合以及輻射前后該轉(zhuǎn)錄因子與IER5基因啟動(dòng)子內(nèi)相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合有無變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、IER5基因啟動(dòng)子-388～-382區(qū)域、-274～-270區(qū)域內(nèi)的GCF結(jié)合位點(diǎn)突變可以引起啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著增加(P＜0.05),并且照射前后轉(zhuǎn)錄活性變化明顯(P＜0.05);而-362～-357區(qū)域內(nèi)的NFI結(jié)合位點(diǎn)突變可

8、以引起啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著下降(P＜0.05),并且照射前后轉(zhuǎn)錄活性變化明顯(P＜0.05);-351～-345區(qū)域內(nèi)的TTR inverted-repeat結(jié)合位點(diǎn)突變對啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性影響不大(P＞0.05),并且照射前后沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　 2、轉(zhuǎn)錄因子GCF在體外與IER5基因啟動(dòng)子-388～-382區(qū)域、-274～-270區(qū)域內(nèi)的GCF結(jié)合位點(diǎn)相互結(jié)合,并且在輻射下,隨著輻射劑量的增加(Ogy、2Gy、4G

9、y),轉(zhuǎn)錄因子GCF與啟動(dòng)子相應(yīng)結(jié)合區(qū)域結(jié)合能力減弱。
　　 3、在HepG2細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GCF與IER5基因啟動(dòng)子-388～-382區(qū)域、-274～-270區(qū)域內(nèi)的GCF結(jié)合位點(diǎn)相互結(jié)合,并且隨著輻射劑量的增加(0Gy、2Gy、4Gy),轉(zhuǎn)錄因子GCF與啟動(dòng)子相應(yīng)結(jié)合區(qū)域結(jié)合能力減弱。
　　 結(jié)論:
　　 1、IER5基因啟動(dòng)子-388～-382和-274～-270區(qū)域存在起負(fù)性調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子GCF順式作