小鼠DsbA-L基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、第一部分鑒定調(diào)控小鼠DsbA-L基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子
　　目的:
　　二硫鍵氧化還原酶類似蛋白(DsbA-L)是近年發(fā)現(xiàn)的一種與脂聯(lián)素多聚體形成有關(guān)的重要調(diào)節(jié)蛋白,它具有顯著上調(diào)高分子量脂聯(lián)素水平及增強(qiáng)胰島素敏感性的作用,并且能緩解由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的脂聯(lián)素水平下降。DsbA-L轉(zhuǎn)基因小鼠可抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、胰島素抵抗和脂肪肝。DsbA-L在脂肪組織高度表達(dá),表達(dá)量隨脂肪細(xì)胞的分化顯著增加。DsbA-L水平與肥胖呈負(fù)相關(guān)。

2、目前對DsbA-L基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控鮮有研究。本研究擬對小鼠DsbA-L基因啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析,探討DsbA-L基因啟動(dòng)子區(qū)及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對DsbAL表達(dá)的作用和可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.構(gòu)建DsbA-L基因全長啟動(dòng)子及5′或3′端系列缺失的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染HEK293和3T3-L1細(xì)胞,通過雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)檢測報(bào)告基因活性,明確調(diào)控DsbA-L表達(dá)的重要啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)合生物信息學(xué)分析對DsbA-

3、L基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起關(guān)鍵作用的潛在順式作用元件。
　　2.針對潛在的順式作用元件,構(gòu)建DsbA-L基因突變體熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒,雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析該作用元件對啟動(dòng)子活性的影響。
　　3.電泳遷移率變動(dòng)分析法(EMSA)以及染色體免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)順式作用元件與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的特異結(jié)合。
　　4.通過RNA干擾和過表達(dá)Sp1分析其對DsbA-L基因啟動(dòng)子活性的影響。
　　5.采用實(shí)時(shí)熒光定量PC

4、R及EMSA實(shí)驗(yàn)分析脂肪細(xì)胞分化以及高脂飲食干預(yù)對DsbA-L基因轉(zhuǎn)錄影響的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1. DsbA-L基因最小啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-186~-34。
　　2.內(nèi)含子1的+391~+432區(qū)域存在一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)。EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sp1與該區(qū)域DNA之間存在特異性結(jié)合。過表達(dá)和RNA干擾實(shí)驗(yàn)分析顯示,Sp1具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　3.3T3-L1脂肪細(xì)胞分化過程中

5、,DsbA-L轉(zhuǎn)錄水平顯著升高;Sp1的表達(dá)水平降低,Sp1與其位于DsbA-L基因內(nèi)含子1區(qū)域的DNA結(jié)合能力降低。
　　4.與對照組相比,高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織 DsbA-L基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,Sp1與其位于DsbA-L基因內(nèi)含子1區(qū)域的DNA結(jié)合能力亦顯著降低。
　　結(jié)論:
　　轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過與DsbA-L基因內(nèi)含子區(qū)域的作用元件相互作用負(fù)調(diào)DsbA-L基因的轉(zhuǎn)錄。
　　第二部分白藜蘆醇對Ds

6、bA-L基因的調(diào)控作用及其機(jī)制
　　目的:
　　探討白藜蘆醇上調(diào)DsbA-L基因表達(dá)的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot的方法檢測白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞中DsbA-L mRNA和蛋白水平的影響。
　　2.以熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析白藜蘆醇對DsbA-L基因啟動(dòng)子活性的影響。
　　3.用電泳遷移率變動(dòng)分析法(EMSA)檢測白藜蘆醇對轉(zhuǎn)錄因

7、子Sp1與DsbA-L基因內(nèi)含子區(qū)DNA結(jié)合的影響。
　　4.用Western blot方法檢測白藜蘆醇對Sp1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.在HepG2細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞中,白藜蘆醇能夠上調(diào)DsbA-L mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　2.白藜蘆醇可以顯著增加DsbA-L基因啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒p(-186 to+432)Luc的熒光素酶活性,而對缺失Sp1結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因質(zhì)粒p(-186 to+4