利用基因修飾小鼠模型研究Sumf2基因的功能和Prss37的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、第一部分小鼠基因功能的研究
　　運(yùn)用轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)，從整體動(dòng)物水平研究基因功能和人類疾病的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的藥物靶點(diǎn)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)研究領(lǐng)域中最常用的技術(shù)手段之一。Sumf2基因?qū)儆诹蛩狨ッ感揎椧蜃映易澹c其家族成員Sumf1為旁系同源基因，它們的蛋白產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上相似。文獻(xiàn)報(bào)道，SUMF1基因的缺失或突變會(huì)導(dǎo)致多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥（簡(jiǎn)稱MSD)的發(fā)生，而 Semf2基因的功能尚不明確。本研究中，我們建立了Smf2條件性

2、和全身性基因敲除小鼠來(lái)研究該基因的生理功能并探索其可能的作用機(jī)制。
　　小鼠Sumf2共有9個(gè)外顯子，在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)。為研究該基因的功能，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析，選擇將其5個(gè)轉(zhuǎn)錄本共用的第三外顯子作為flox區(qū)域，并通過(guò)ET克隆技術(shù)構(gòu)建了打靶載體，經(jīng)小鼠胚胎干細(xì)胞打靶，獲得了19個(gè)正確同源重組的陽(yáng)性克?。?yáng)性率20％);經(jīng)顯微注射和嵌合鼠繁育，獲得28只灰鼠，經(jīng)PCR鑒定16只為flox雜合小鼠；flox小鼠與EIIA-cre轉(zhuǎn)

3、基因小鼠交配，獲得Sem/2基因敲除小鼠，進(jìn)一步的RT-PCR和Western-blot檢測(cè)證明該基因已被成功剔除。初步的表型分析結(jié)果顯示，Semf2基因缺失小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育未見(jiàn)異常，其血常規(guī)及肝腎功等血生化指標(biāo)與野生型小鼠相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，只是純合小鼠的血清CK及CK-MB比野生型小鼠明顯增高。該基因的生物學(xué)功能尚需進(jìn)一步研究。
　　第二部分Prss37的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
　　絲氨酸蛋白酶超家族是發(fā)現(xiàn)最早，也是最大、最多樣的酶

4、家族之一，該家族成員Prss37是一種分泌蛋白，屬于該超家族的激肽釋放酶家族，在哺乳動(dòng)物中高度保守。課題組對(duì)Pthh37基因剔除小鼠模型的研究證實(shí)，該基因的缺失可以造成雄性不育，但并不影響雌鼠的生殖力，進(jìn)一步的分析表明該基因特異性表達(dá)于小鼠睪丸組織，其缺失并不影響精子發(fā)生及交配行為，只是影響精子在雌鼠生殖道內(nèi)的遷移和受精過(guò)程中的精卵結(jié)合，它是研究雄性不育和避孕藥物研發(fā)重要的候選基因。
　　Pthh37基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制迄今未見(jiàn)報(bào)道

5、，為進(jìn)一步研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，獲得藥物研發(fā)所需的動(dòng)物模型，我們運(yùn)用cDNA5’末端快速擴(kuò)增法(5’RACE)對(duì)C57BL/6J小鼠睪丸mRNA進(jìn)行分析，確定了該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并構(gòu)建了不同長(zhǎng)度Pthh37啟動(dòng)子（lKb、2Kb、4Kb)驅(qū)動(dòng)的熒光素酶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，通過(guò)小鼠雄原核顯微注射的方法，建立了一系列Pthh37啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)的熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型。經(jīng)繁育我們成功獲得了熒光素酶報(bào)告基因在小鼠睪丸表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，詳細(xì)的組織