NGF、Noggin基因修飾的rBMSCs移植治療帕金森病大鼠模型的實驗研究.pdf

1、目的:1.通過立體定向技術將6-OHDA直接注射到前腦內(nèi)側(cè)束來建立一種簡單、有效的PD大鼠模型，為下一步研究奠定基礎。2.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離、擴增方法。3.判斷重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-NOGGIN對rBMSCs的轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染對細胞的影響以及目的蛋白的表達情況。4.對比觀察化學誘導劑、NGF及Noggin對rBMSCs像神經(jīng)元樣細胞方向分化的誘導作用。5.探討攜帶NGF及Noggi n的

2、rBMSCs對PD模型大鼠神經(jīng)功能的修復作用及其機制。
　　 方法:1.應用6-OHDA立體定向顱內(nèi)注射制備PD大鼠模型。用阿樸嗎啡皮下注射檢測造模是否成功。2.取SD大鼠長骨骨髓作為供體來源，經(jīng)貼壁篩選法進行體外培養(yǎng)并純化rBMSCs。通過細胞表面標志、成骨細胞誘導和成脂細胞誘導對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。3.通過不同濃度的重組腺病毒選擇轉(zhuǎn)染最合適的MOI值。將rBMSCs分成5組分別為未轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-N

3、GF轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-Noggin轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin聯(lián)合轉(zhuǎn)染組，觀察轉(zhuǎn)染對rBMSCs生長的影響，通過免疫熒光檢測目的蛋白的表達。4.通過化學誘導劑和基因修飾誘導rBMSCs向神經(jīng)元樣細胞方向分化，并檢測其神經(jīng)細胞標志物的表達。5.通過立體定向顱內(nèi)注射將經(jīng)過基因修飾的rBMSCs移植入模型大鼠損毀側(cè)紋狀體。記錄單位時間阿樸嗎啡誘發(fā)的模型大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，觀察大鼠神經(jīng)功能恢復情況。通過免疫熒光檢測移植

4、細胞在腦內(nèi)存活、分布以及向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞方向分化的情況。免疫組化法檢測細胞移植后第四周大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性細胞計數(shù)。通過高效液相檢測大鼠紋狀體DA、DOPAC、HVA含量。
　　 結(jié)果:1.6-OHDA顱內(nèi)注射制備的帕金森病大鼠模型具有良好的穩(wěn)定性，該模型的制備為下一步實驗奠定了基礎。2.貼壁法能夠篩選獲得純度較高，活性良好的rBMSCs，具有相關表型，能向成骨細胞和成脂細胞分化。3.重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-

5、NGF、Ad-GFP-Noggin在MOI=50pfu/cell條件下對rBMSCs轉(zhuǎn)染效率高，對rBMSCs毒性最小。經(jīng)NGF、Noggin修飾的重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的rBMSCs在發(fā)出綠色熒光的同時，能分別表達相應蛋白產(chǎn)物，免疫熒光染色呈紅色熒光。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組rBMSCs則同時呈現(xiàn)NGF、Noggin免疫熒光陽性反應。4.rBMSCs在化學誘導劑作用下，5h后出現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)，免疫熒光染色顯示神經(jīng)元標志物NF（H）呈陽性，星形膠質(zhì)細胞標志

6、物GFAP呈陰性，但細胞大量死亡。各轉(zhuǎn)染組rBMSCs中Ad-GFP轉(zhuǎn)染組細胞形態(tài)無改變，Ad-GFP-NGF轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-Noggin轉(zhuǎn)染組及聯(lián)合轉(zhuǎn)染組rBMSCs在轉(zhuǎn)染后72h呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)，部分細胞免疫熒光染色顯示NF（H）陽性，GFAP陰性，分化后的細胞可長期存活。其中聯(lián)合轉(zhuǎn)染組NF（H）陽性率最高。5.經(jīng)立體定向?qū)⒓毎浦踩肽Ｐ痛笫髶p毀側(cè)紋狀體一周后，大鼠神經(jīng)功能均有所改善，由阿樸嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少，其中聯(lián)合

7、轉(zhuǎn)染組最為明顯。鏡下發(fā)現(xiàn)，移植細胞自注射部位向周圍擴散，分布于紋狀體、皮層下、海馬及對側(cè)半球。移植后兩周，免疫熒光檢測部分存活移植細胞NF（H）有陽性表達，另有部分細胞呈GFAP陽性。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組NF（H）和GFAP陽性細胞比例最高。移植后四周，免疫組化檢測各組模型黑質(zhì)TH陽性細胞生存率，基因修飾組有增多的趨勢，但各組差異無統(tǒng)計學意義。高效液相檢測大鼠紋狀體DA、DOPAC、HVA含量損毀側(cè)同健側(cè)之比，各細胞移植組比值均較未移植組和PBS

8、組高，其中Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin聯(lián)合轉(zhuǎn)染組比值最高。
　　 結(jié)論:1.6-OHDA立體定向顱內(nèi)注射法制備PD大鼠模型具有良好的穩(wěn)定性及可重復性。2.通過貼壁篩選法能有效純化骨髓，獲得高純度rBMSCs，并且該方法簡單實用，對細胞影響小，能滿足大多數(shù)研究需求。通過流式細胞技術檢測細胞表面標志，以及成骨、成脂誘導能夠?qū)BMSCs進行有效鑒定。3.重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-

9、Noggin均能安全、有效地轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs，并穩(wěn)定表達GFP、NGF和Noggin蛋白。4.體外環(huán)境下，化學誘導劑和NGF和Noggin蛋白均能將rBMSCs誘導成為神經(jīng)元樣細胞，但化學誘導劑對細胞存活有明顯影響，而后兩者不影響細胞存活，并可促進細胞向神經(jīng)元方向分化。5.立體定向?qū)⒒蛐揎椀膔BMSCs移植入大鼠損毀側(cè)紋狀體，移植細胞可在腦內(nèi)存活、遷移并分化為具有神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞表型的細胞，通過多種途徑有效改善模型大鼠