Stathmin基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、Stathmin基因是一個(gè)與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的癌基因，研究表明，該基因在大多數(shù)的惡性腫瘤中均呈過表達(dá)狀態(tài)，阻斷它的表達(dá)可有效的逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的生物學(xué)表型。然而目前，關(guān)于stathmin基因過表達(dá)的調(diào)控機(jī)理卻尚未完全闡明，我們對(duì)stathmin基因5’端的啟動(dòng)子區(qū)及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行了較全面的分析研究，以期最終揭示惡性腫瘤細(xì)胞中stathmin基因過表達(dá)的調(diào)控機(jī)理，希望為發(fā)掘惡性腫瘤診治新靶點(diǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　目的：

2、為了研究stathmin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，首先從基因組DNA中擴(kuò)增stathmin基因啟動(dòng)子序列，并且對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)，然后用PCR的方法獲得不同截短型的stathmin基因啟動(dòng)子，確定stathmin基因啟動(dòng)子核心區(qū)，接著對(duì)核心啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)對(duì)其有調(diào)控作用的一些重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，最后研究這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對(duì)stathmin基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用，并探討它們?cè)趷盒阅[瘤細(xì)胞中對(duì)stathmin基因過表達(dá)的作用機(jī)制，以期從轉(zhuǎn)錄調(diào)控的角

3、度揭示stathmin基因過表達(dá)的機(jī)理。
　　方法：（1）首先設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增全長stathmin基因啟動(dòng)子序列的引物，以A549細(xì)胞基因組DNA為模板，通過PCR的方法，擴(kuò)增stathmin基因啟動(dòng)子；然后，我們將全長的stathmin基因啟動(dòng)子連入啟動(dòng)子活性檢測(cè)的專用載體pGL3-Basic/LUC和pGL3-Basic/EGFP中，命名為pGL3-Basic/LUC/stap和pGL3-Basic/EGFP/stap，將重組質(zhì)粒

4、分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和A549細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因熒光素酶和綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，驗(yàn)證stathmin基因啟動(dòng)子的活性。（2）設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增不同截短型stathmin基因啟動(dòng)子的引物，通過PCR的方法擴(kuò)增相應(yīng)的啟動(dòng)子片段，并且連入啟動(dòng)子活性檢測(cè)專用載體，通過報(bào)告基因的表達(dá)情況檢測(cè)啟動(dòng)子的活性變化。（3）用啟動(dòng)子分析軟件對(duì)核心啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在核心啟動(dòng)子上存在E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1的結(jié)合位點(diǎn)，針對(duì)這些結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成含

5、有預(yù)期突變位點(diǎn)的引物，然后以待突變的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，構(gòu)建含有預(yù)期突變位點(diǎn)的報(bào)告基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)變化；接著進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1特異性抗體的作用，得到與它們相結(jié)合的DNA片段，然后通過PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在細(xì)胞內(nèi)是否可以與結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合。（4）在過表達(dá)和干涉實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1全長的真核表達(dá)載體和干涉

6、載體，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及stathmin基因的表達(dá)情況。（5）通過不同方法（PMA、UV、DOX等）上調(diào)Egr1的表達(dá)，然后從mRNA和蛋白水平檢測(cè)stathmin的表達(dá)情況；構(gòu)建Egr1位點(diǎn)突變的全長stathmin基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，檢測(cè)啟動(dòng)子活性變化；通過染色質(zhì)免疫共沉淀和凝膠遷移試驗(yàn)檢測(cè)Egr1與stathmin基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況；通過不通的方式（UV、DOX及p5

7、3真核表達(dá)載體等）作用于A549細(xì)胞和A549-KE細(xì)胞（轉(zhuǎn)染了Egr1干涉載體），通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)和WesternBlot檢測(cè)stathmin基因啟動(dòng)子的活性及表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：（1）獲得的stathmin基因啟動(dòng)子經(jīng)測(cè)序和雙酶切鑒定證實(shí)所擴(kuò)增序列與GenBank中報(bào)道序列一致，將pGL3-Basic/LUC/stap和pGL3-Basic/EGFP/stap載體分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和A549細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)

8、，結(jié)果表明：stathmin基因啟動(dòng)子可以調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)，并且它的啟動(dòng)子活性明顯強(qiáng)于另一個(gè)腫瘤相關(guān)啟動(dòng)子survivin基因啟動(dòng)子。（2）運(yùn)用PCR的方法獲得了不同截短型的啟動(dòng)子片段分別為：1500bp、1000bp、600bp、400bp及200bp，通過酶切及測(cè)序鑒定所獲得的不同長度的啟動(dòng)子序列正確，同時(shí)對(duì)它們的調(diào)控活性檢測(cè)結(jié)果表明，報(bào)告基因均顯示400bp的啟動(dòng)子片段活性最強(qiáng)。（3）位點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)中，成功構(gòu)建了含有預(yù)期突變位點(diǎn)的

9、重組報(bào)告基因質(zhì)粒，通過報(bào)告基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)E2F1、NF-Y、Sp1結(jié)合位點(diǎn)突變以后，核心啟動(dòng)子的活性均有或多或少的減弱，而Egr1結(jié)合位點(diǎn)突變以后，核心啟動(dòng)子的活性明顯增強(qiáng)；染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)證實(shí)了這四個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子都可以和stathmin基因核心啟動(dòng)子上的預(yù)測(cè)位點(diǎn)直接結(jié)合。（4）在過表達(dá)試驗(yàn)中，E2F1、NF-Y、Sp1的增加可以不同程度的上調(diào)stathmin基因的表達(dá)，而Egr1表達(dá)的增加則可明顯下調(diào)stathmin基因表達(dá)水平

10、；干涉試驗(yàn)中，E2F1、NF-Y、Sp1的表達(dá)降低可以不同程度的下調(diào)stathmin基因的表達(dá)，而Egr1表達(dá)的降低則可明顯上調(diào)stathmin基因的表達(dá)水平。（5）增加細(xì)胞內(nèi)Egr1的表達(dá)可以從mRNA和蛋白水平減低stathmin的表達(dá)；Egr1可以與stathmin基因啟動(dòng)子上的Egr1位點(diǎn)直接結(jié)合，調(diào)控stathmin基因啟動(dòng)子的活性；在A549細(xì)胞中，通過上調(diào)p53的表達(dá)，可以誘導(dǎo)Egr1的表達(dá)增加，使得stathmin基因的

11、表達(dá)水平下降；但是在A549-KE細(xì)胞中，上調(diào)的p53并沒有改變Egr1和stathmin基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：（1）獲得了全長的stathmin基因啟動(dòng)子，并且經(jīng)測(cè)序鑒定，與GeneBank中報(bào)道的序列一致；而且通過對(duì)該啟動(dòng)子活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，stathmin基因啟動(dòng)子的活性明顯強(qiáng)于另一個(gè)與腫瘤相關(guān)的survivin基因啟動(dòng)子。（2）獲得了正確的不同截短型的啟動(dòng)子片段，并且確定了400bp的stathmin基因啟動(dòng)子核心區(qū)域

12、。（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1可以通過作用于stathmin基因核心啟動(dòng)子上的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控核心啟動(dòng)子的活性。（4）E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1均能夠調(diào)控stathmin表達(dá)，其中E2F1、NF-Y、Sp1可以不同程度的上調(diào)它的表達(dá)，而Egr1則能夠下調(diào)stathmin的表達(dá)，并且Egr1的調(diào)控作用最明顯。（5）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Egr1可以從轉(zhuǎn)錄水平抑制stathmin表達(dá)，p53能夠通過Egr1介導(dǎo)對(duì)