轉(zhuǎn)錄與基因表達(dá)調(diào)控

1、第十五章 RNA的生物合成,,RNA生物合成： 1.轉(zhuǎn)錄 2.RNA復(fù)制,RNA RNARNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，或依賴于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶,,第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄的基本特征,轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板、NTP為原料，按堿基配對(duì)原則，在RNA聚合酶的催化下合成與DNA互補(bǔ)的RNA鏈的過(guò)程。,一、轉(zhuǎn)錄的模板,模板鏈：DNA雙鏈中能指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的DNA單鏈，又稱反義鏈（負(fù)鏈）。編

2、碼鏈：與模板鏈堿基配對(duì)、在DNA雙鏈中不能指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的DNA單鏈，又稱為有義鏈（正鏈）。,,,,,5?3?,3?5?,模板鏈,編碼鏈,編碼鏈,模板鏈,,轉(zhuǎn)錄方向,,轉(zhuǎn)錄方向,DNA,轉(zhuǎn)錄模板,,轉(zhuǎn)錄單位：RNA的生物合成始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一個(gè)位點(diǎn)處終止，這一特定區(qū)域稱為轉(zhuǎn)錄單位，又稱為“結(jié)構(gòu)基因”。啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)。終止子：轉(zhuǎn)錄終止控制區(qū)。,轉(zhuǎn)錄單位,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)（開(kāi)放閱讀框）,DNA,不對(duì)稱轉(zhuǎn)

3、錄的概念：,對(duì)于一個(gè)基因而言，處在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段, 一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄對(duì)于不同基因而言，模板鏈并非全部在同一條DNA單鏈上,,,,,5?3?,3?5?,模板鏈,編碼鏈,編碼鏈,模板鏈,,轉(zhuǎn)錄方向,,轉(zhuǎn)錄方向,DNA,RNA聚合酶：催化DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA的酶。又稱DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，或DNA依賴的RNA聚合酶。,RNA合成的化學(xué)機(jī)制與DNA依賴的DNA聚合酶催化DNA合成（復(fù)制）相似。,( NM

4、P )n + NTP → ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延長(zhǎng)的RNA,二、RNA聚合酶（RNA pol）,1.原核生物RNA聚合酶,DNA聚合酶在啟動(dòng)DNA鏈延長(zhǎng)時(shí)需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動(dòng)RNA鏈的延長(zhǎng)。RNA聚合酶和DNA的特殊序列——啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合后，就能啟動(dòng)RNA合成。,原核生物RNA聚合酶由5個(gè)亞基組成：a2bb‘s，是RNA聚合酶的全酶。其中a2bb’又稱為RNA聚

5、合酶的核心酶。s為啟動(dòng)因子。,,,,利福平抑制?亞基：是抑制結(jié)合桿菌的特效藥,2.真核生物的RNA聚合酶,依據(jù)對(duì)鵝膏蕈堿的敏感性，真核細(xì)胞的RNA聚合酶分為三類(lèi)：,,三、啟動(dòng)子,（一）原核生物啟動(dòng)子,1. 啟動(dòng)子:RNA聚合酶與DNA模板結(jié)合的序列。,研究方法：RNA聚合酶保護(hù)法（足跡法）,,開(kāi)始轉(zhuǎn)錄,,T T G A C AA A C T G T,-35 區(qū),(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T

6、T A Py,-10 區(qū),,,,RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(Sextama box，recognition site),用RNA聚合酶保護(hù)法研究轉(zhuǎn)錄起始區(qū),A為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，而90%以上的基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為嘌呤（A/G）。,（1） Pribnow box （又稱-10序列）：,A為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，而90%以上的基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為嘌呤（A/G）。,保守序列為：TTGACA，該序列被s因子所識(shí)別，是RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)，即為RNA聚合酶最早結(jié)合的位點(diǎn)。

7、此位點(diǎn)序列很大程度決定啟動(dòng)子強(qiáng)度，RNA聚合酶易識(shí)別強(qiáng)的啟動(dòng)子。,（2） Sextama box （又稱-35序列）：,RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合,過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)的間隔區(qū)序列都會(huì)影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子序列的穩(wěn)定性而最終影響到轉(zhuǎn)錄活性。,RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合:,2.真核生物啟動(dòng)子,催化不同種類(lèi)的RNA合成。RNA聚合酶II的啟動(dòng)子序列多樣。RNA聚合酶II完成了hnRNA的合成作用。,真核生物 RNA聚合酶的啟動(dòng)子有三種：

8、 I、II、III。對(duì)應(yīng)各自的RNA聚合酶。,RNA聚合酶II啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)區(qū)的通用序列為PyPyCAPyPyPy，其中A為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（+1），Py為嘧啶堿基。即在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)A的兩側(cè)有多個(gè)嘧啶核苷酸。真核RNA聚合酶II起始點(diǎn)序列特征與原核生物E.coli轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的規(guī)律一致。,（1）帽子位點(diǎn)（cap site）,又稱基本啟動(dòng)子，在-30~-25區(qū)域，通用序列為T(mén)ATA(A/T)A(A/T)。RNA聚合酶II與TATA框結(jié)合

9、后才能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。類(lèi)似原核Pribnow box。啟動(dòng)子若缺乏TATA框，轉(zhuǎn)錄會(huì)在許多位點(diǎn)開(kāi)始。,（2）TATA框（TATA box）,保守序列為GG(C/T)CAATCT，一般位于-75附近。該序列可能與控制轉(zhuǎn)錄起始的效率有關(guān)。,（3） CAAT框（CAAT box）,增強(qiáng)子是指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列，一般在-100以上的區(qū)域。有效的增強(qiáng)子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的還可位于基因的內(nèi)含

10、子中。大多為重復(fù)序列。,（4）增強(qiáng)子（enhancer）,第二節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄,1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始,1） s因子與核心酶結(jié)合為RNA聚合酶的全酶2）s因子找到起始位點(diǎn)，RNA聚合酶與-35序列結(jié)合，即為“DNA-RNA聚合酶”的閉鏈?zhǔn)蕉獜?fù)合物3）RNA聚合酶向-10序列滑動(dòng)，并牢固結(jié)合-10序列，在-10序列與起始點(diǎn)處發(fā)生局部解鏈，形成開(kāi)鏈?zhǔn)蕉獜?fù)合物。,5）在b亞基催化下形成RNA的第一個(gè)磷酸二酯鍵，形成了“DNA-RN

11、A-RNA聚合酶”的三元復(fù)合物6）三元復(fù)合物形成并生成6-9個(gè)核苷酸后，σ亞基脫落，核心酶與DNA親和力下降，有利于核心酶在DNA鏈上的滑動(dòng). σ亞基如果不脫落，轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)入延長(zhǎng)階段，并有可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄流產(chǎn)。,三元復(fù)合物,轉(zhuǎn)錄的起始,RNA聚合酶全酶+啟動(dòng)子DNA處于雙鏈狀態(tài),聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開(kāi),RNA聚合酶、DNA和新生RNA,RNA聚合酶核心酶離開(kāi)啟動(dòng)子，沿DNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過(guò)程就是

12、轉(zhuǎn)錄的延伸。,共價(jià)地向生長(zhǎng)RNA鏈的3’端添加核糖核苷酸 RNA聚合酶是以5’? 3’ 方向來(lái)延長(zhǎng)RNA鏈 RNA聚合酶本身沿著模板鏈以3’ ? 5’方向移動(dòng)RNA鏈的延長(zhǎng)并非恒定速度進(jìn)行，有延宕現(xiàn)象。,2.轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)錄空泡：即為延長(zhǎng)階段的“DNA-RNA-RNA聚合酶”三元復(fù)合體,DNA/DNA雙鏈比DNA/RNA雜化雙鏈穩(wěn)定G-C>A-T>A-U,轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5?,3

13、?,,,,,,,,DNA,,,原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象,,核糖體,,,RNA,,,RNA聚合酶,,在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行；轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行。,這種形狀說(shuō)明：,電鏡下轉(zhuǎn)錄過(guò)程的羽毛狀結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板移動(dòng)，直至遇到終止信號(hào)，停頓下來(lái)不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來(lái)。,3. 轉(zhuǎn)錄的終止,轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)存在于RNA聚合酶已轉(zhuǎn)錄過(guò)的序列中。,終止子：提供終止信號(hào)的序列。,在

14、轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段回文結(jié)構(gòu)，回文序列的兩個(gè)重復(fù)部分（7-22bp）由一小段不重復(fù)區(qū)隔開(kāi)，從而形成一個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。原核生物兩種轉(zhuǎn)錄終止模式： 不依賴蛋白輔助因子（r因子）的終止模式 依賴蛋白輔助因子（r因子）的終止模式,終止子結(jié)構(gòu)特征：,終止子結(jié)構(gòu)特征,,不依賴r因子的終止子 莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中G-C含量豐富，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)之后有一個(gè)poly(U)區(qū)。,依賴r因子終止子 莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中G-C含量低，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)

15、之后沒(méi)有特定特征。,（1）r因子附著在新生RNA鏈，通過(guò)消耗ATP沿新生鏈5'?3'方向前行，至與RNA聚合酶結(jié)合（2）當(dāng)出現(xiàn)依賴r因子的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)時(shí)，r因子結(jié)合此特征結(jié)構(gòu)，促使了“DNA-RNA-RNA聚合酶”三元復(fù)合物解聚，釋放出新生RNA鏈，完成了轉(zhuǎn)錄過(guò)程,1）依賴r因子的終止,ρ因子的作用原理：,polyC,,,ρ因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。ρ因子能結(jié)合RNA，又以對(duì)poly C

16、的結(jié)合力最強(qiáng)。ρ因子還有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。,轉(zhuǎn)錄終止不需要r因子的參加，當(dāng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)時(shí)(內(nèi)在終止子 ) ，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)自身就可以使“DNA-RNA-RNA聚合酶”三元復(fù)合體解聚，釋放出RNA新生鏈，完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。,2）不依賴r因子的終止作用,不依賴r因子的轉(zhuǎn)錄終止,,莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理：,使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。,RNA合成過(guò)程,起始階段,雙鏈

17、DNA局部解開(kāi),磷酸二酯鍵形成,終止階段,解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn),延長(zhǎng)階段,,,,,,,RNA,啟動(dòng)子（promoter),終止子(terminator),,,真核生物轉(zhuǎn)錄遠(yuǎn)復(fù)雜過(guò)原核生物，其轉(zhuǎn)錄激活需要大量各種各樣的轉(zhuǎn)錄因子參加目前對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制了解不多在hnRNA轉(zhuǎn)錄后期的新生鏈會(huì)出現(xiàn)“AAUAAA”這個(gè)特征序列，被認(rèn)為是RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào),第三節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄,一 、轉(zhuǎn)錄起始,轉(zhuǎn)錄因子,

18、能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factors, TF)。,參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ,,TFⅡF,,,ⅡA,,,ⅡB,,,,,由RNA-Pol Ⅱ催化轉(zhuǎn)錄的PIC,ⅡH,ⅡE,TBP,TAF,TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合物,TATA

19、,ⅡA,,ⅡB,TBP,TAF,TATA,ⅡH,ⅡE,PIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化,二、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng),真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。,,RNA-Pol,,RNA-Pol,,RNA-Pol,核小體,轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)中的核小體移位,,,,,轉(zhuǎn)錄方向,三、轉(zhuǎn)錄終止,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)

20、的。真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的。轉(zhuǎn)錄不是在poly A的位置上終止，而是超出數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當(dāng)多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。,5?------AAUAAA-,,5? ------AAUAAA--,核酸酶,,-GUGUGUG,RNA-pol,,AATAAA GTGTGTG,轉(zhuǎn)錄終止的修

21、飾點(diǎn),,,5?,5?,3?,3?,,,3?加尾,AAAAAAA······ 3? mRNA,,轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān),DNA讀碼框架下游的一組AATAAA和GT共同序列, 參與轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程。,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾,第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄后加工,由RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，往往需要經(jīng)過(guò)一系列的結(jié)構(gòu)改造或修飾，這個(gè)過(guò)程稱為RNA的成熟，或稱為轉(zhuǎn)錄后加工。,

22、1. RNA鏈的裂解2.5 ’端與3’端的切除3.剪接4.特殊結(jié)構(gòu)的形成5.堿基修飾和糖苷鍵的改變,轉(zhuǎn)錄后加工包括：,,3. 修飾 (modification) 如：G ? m7G4. 添加 (addition) 如添加帽子結(jié)構(gòu)、尾巴結(jié)構(gòu)、氨基酸臂等5. 編輯 (editing),轉(zhuǎn)錄后加工的主要方式,原核生物的mRNA通常沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程。原核生物rRNA 和tRNA必須經(jīng)歷剪切和修飾加工過(guò)程,,,,

23、,,,剪切,剪接,一、tRNA和rRNA的加工,即在tRNA3'末端添加-CCA氨基酸臂。,,,添加,修飾作用① 甲基化：G?mG② 還原：U? DHU③ 脫氨: A? I④ 轉(zhuǎn)位: U?Ψ,原核 rRNA 前體加工過(guò)程,甲基化,rRNA的甲基化 即真核45s rRNA在進(jìn)行剪切之前首先進(jìn)行了甲基化反應(yīng)。,,1. 5'-端加帽,二、真核生物mRNA的加工,5? pppGp…,帽子結(jié)構(gòu)的生成過(guò)程：,加

24、帽,2. 3‘-端加尾（多聚腺苷酸化）,mRNA 尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行的過(guò)程。在大多數(shù)真核mRNA3'末端添加多聚腺苷酸尾巴（poly A），長(zhǎng)度大約在250個(gè)左右。 尾巴結(jié)構(gòu)的功能不詳，一般認(rèn)為尾巴結(jié)構(gòu)提高的mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性即半衰期。,5?------AAUAAA-,,5? ------AAUAAA--,核酸酶,,-GUGUGUG,RNA-pol,,AATAAA GTGTGTG,轉(zhuǎn)錄終止的

25、修飾點(diǎn),,,5?,5?,3?,3?,,,3?加尾,AAAAAAA······ 3? mRNA,,轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后加工密切相關(guān),DNA讀碼框架下游的一組AATAAA和GT共同序列, 參與轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程。,3. 剪接作用,剛生成的hnRNA沒(méi)有活性，除了需要添加帽子和尾巴結(jié)構(gòu)外，還需要經(jīng)過(guò)剪接作用切除內(nèi)含子，連接外顯子，才能轉(zhuǎn)化為有轉(zhuǎn)錄活性的mRNA。,,mRNA,真核

26、生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開(kāi)但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。,斷裂基因(splite gene),編碼區(qū) A、B、C、D,內(nèi)含子和外顯子,外顯子：在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過(guò)程中被除去的核酸序列。,內(nèi)含子的“功能”及其在生物進(jìn)化中的地位是一個(gè)引人注目的問(wèn)題。,雞卵清蛋白基因,h

27、nRNA,首、尾修飾,hnRNA剪接,成熟的mRNA,雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾,生物體內(nèi)的各種內(nèi)含子,剪接過(guò)程：,剪接體識(shí)別結(jié)合hnRNA的內(nèi)含子5´及3´區(qū)域形成套索RNA (lariat RNA)，外顯子靠近兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，切去內(nèi)含子，連接外顯子,III類(lèi)內(nèi)含子剪接 -----mRNA的剪接,—— 除去hnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接。,snRNP與hnRNA結(jié)合成為剪接體,①,5’剪接點(diǎn):↓GU-

28、- 3’剪接點(diǎn): --AG↓,,,pG-OH(ppG-OH, pppG-OH),,,剪接過(guò)程的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng) (twice transesterification),,,,,,,可變剪接,轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的異同,均以DNA為模板原料為三磷酸核苷酸堿基遵循堿基配對(duì)原則聚合反應(yīng)生成：3',5'-磷酸二酯鍵核酸鏈合