人PNRC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、富含脯氨酸的核受體輔活化因子(proline-richnuclearreceptorcoactivator，PNRC)是最近克隆和鑒定的一種新的核受體輔活化因子，是以類固醇源性生長(zhǎng)因子(steridogenticfactor1，SF1)作誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人乳腺cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選得到的。PNRC通過其位于C端的SH3(srchomology3)結(jié)合模體發(fā)揮核受體輔活化因子作用，能以配體依賴的方式與多種核受體相互作用，還能與孤

2、兒受體SF1和ERRa1以配體非依賴的方式相互作用。PNRC除了作為核受體的輔活化因子外，還通過SH3結(jié)合模體調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子/Ras信號(hào)通路，競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ras蛋白的激活。PNRC在多種腫瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常組織和細(xì)胞，這提示PNRC的轉(zhuǎn)錄抑制與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 目前關(guān)于PNRC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚，為了研究PNRC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其轉(zhuǎn)錄抑制與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，我們進(jìn)行了如下的研究：

3、 1.人PNRC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定及啟動(dòng)子的活性分析 采用5'端cDNA末端快速擴(kuò)增法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)確定了PNRC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基為G，該轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較報(bào)道的PNRCmRNA(NM006813)5'端第一個(gè)堿基提前了27bp。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件(http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl.)對(duì)

4、人PNRC基因的5'側(cè)翼區(qū)約2100bp的序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)具有啟動(dòng)子功能的區(qū)域。應(yīng)用TransFacprofessional8.1(http://jupiter.coh.org/cgi-bin/transfac/bin/start.cgi)軟件對(duì)該區(qū)域進(jìn)行分析，獲得可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。通過構(gòu)建包含PNRC基因5'上游序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，檢測(cè)熒光素酶活性，對(duì)PNRC啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，啟動(dòng)

5、子活性最小區(qū)域位于-123～+27，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在這一區(qū)域可能存在著NFY和RFX1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 2.細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外鑒定NFY和RFX1與PNRC基因啟動(dòng)子活性區(qū)域的結(jié)合 染色質(zhì)免疫沉淀(chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP)及電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(electrophoresismobilityshiftandsupershiftassay,EMSA)證明：NFY和RFX

6、1可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外與PNRC啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合。 3.NFY和RFX1對(duì)PNRC基因啟動(dòng)子活性的調(diào)控 NFY和RFX1真核表達(dá)質(zhì)粒與PNRC啟動(dòng)子重組報(bào)告基因質(zhì)?；蚺c突變報(bào)告基因質(zhì)粒(含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變)的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明：NFY和RFX1通過與PNRC啟動(dòng)子-123～+27區(qū)域結(jié)合，抑制PNRC啟動(dòng)子的活性，RT-PCR和Westernblot證明：過表達(dá)NFY和RFX1可下調(diào)HepG2細(xì)胞中PNRC的表達(dá)。

7、 4.乳腺癌細(xì)胞中人PNRC基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)的研究 運(yùn)用“MethPrimer”軟件對(duì)PNRC啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)CpG島，通過硫化測(cè)序PCR(BisulfitesequencingPCR，BSP)，檢測(cè)PNRC啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀況，結(jié)果顯示：乳腺癌細(xì)胞中PNRC基因啟動(dòng)子區(qū)存在CpG島的甲基化。 5.PNRC基因啟動(dòng)子CpG島去甲基化對(duì)PNRC轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié) 將含PNRC啟動(dòng)子序列

8、的報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞再經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)處理后，檢測(cè)PNRC基因啟動(dòng)子的活性；RT-PCR、Northem雜交、WesternBlot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后PNRC的表達(dá)情況。結(jié)果證明：PNRC基因啟動(dòng)子CpG島去甲基化可增強(qiáng)PNRC啟動(dòng)子活性并上調(diào)PNRC的表達(dá)。 本研究對(duì)人PNRC基因5'側(cè)翼區(qū)序列進(jìn)行了

9、一系列缺失分析，確定了啟動(dòng)子的最小活性區(qū)域-123～+27，并鑒定了與之相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子NFY和RFX1對(duì)PNRC啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用。此外，我們還從表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面研究了PNRC基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中PNRC基因啟動(dòng)子區(qū)存在CpG島的甲基化，對(duì)PNRC基因啟動(dòng)子CpG島的去甲基化可增強(qiáng)PNRC啟動(dòng)子活性并上調(diào)PNRC的表達(dá)，進(jìn)一步證明了PNRC在乳腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄抑制與PNRC啟動(dòng)子CpG島的甲基化相