擬南芥ACS7基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、植物激素乙烯影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過程，同時(shí)它也參與調(diào)控植物對(duì)環(huán)境中生物或非生物脅迫的響應(yīng)。植物對(duì)體內(nèi)乙烯水平的控制主要通過調(diào)節(jié)乙烯生物合成的關(guān)鍵酶—1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACC synthase,ACS)的表達(dá)和活性來實(shí)現(xiàn)。ACS蛋白由多基因家族編碼，它們的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后多個(gè)水平的調(diào)控。根據(jù)C-末端結(jié)構(gòu)域的不同，ACS家族成員

2、分為三類，其C-末端氨基酸序列的特點(diǎn)決定了它們翻譯后調(diào)控的方式。在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，第一類ACS蛋白包含ACS1、2和6，第二類包含ACS4、5、8、9和11，第三類僅包含ACS7一個(gè)成員。擬南芥的三類ACS蛋白均是通過泛素/26S蛋白酶體途徑降解，其中第一類和第二類ACS的C-末端作為E3泛素連接酶結(jié)合以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，

3、MAPK)或鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)磷酸化的靶位點(diǎn)，參與調(diào)控這兩類ACS蛋白的穩(wěn)定性;目前，對(duì)于第三類ACS蛋白中參與翻譯后調(diào)控的具體區(qū)域或位點(diǎn)仍然不清楚。本課題以模式植物擬南芥的ACS7為代表，研究了第三類ACS蛋白翻譯后調(diào)控的分子機(jī)制。
　　通過對(duì)不同物種來源的第三類ACS蛋白以及擬南芥ACS蛋白家族成員的氨基酸序列比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)第三類ACS蛋白的N-末端相比

4、其他兩類ACS的更長(zhǎng)，因此推測(cè)N-末端可能在第三類ACS蛋白的翻譯后調(diào)控過程中發(fā)揮一定的功能。為了驗(yàn)證這一推論，我們將擬南芥ACS7蛋白N-末端第1-54位氨基酸與報(bào)告基因β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)進(jìn)行融合，構(gòu)建雙元表達(dá)載體并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥ACS7:N7(1-54)-GUS。對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗中GUS融合基因表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)，ACS7 N-末端會(huì)顯著地降低GUS融合蛋白的積累水平和穩(wěn)定性;進(jìn)一步分析表

5、明N-末端的第1-14位氨基酸在參與負(fù)向調(diào)控GUS穩(wěn)定性方面發(fā)揮著主要的作用。同時(shí)，我們分別構(gòu)建了花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GVG系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)全長(zhǎng)(ACS7FL)和缺失N-末端第1-14位氨基酸(ACS7Δ1-14)的ACS7蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。在GVG:A CS7FL-Flag和GVG:ACS7Δ1-14-Flag轉(zhuǎn)基因擬南芥中發(fā)現(xiàn)，兩種形式的ACS7蛋白在催化活性上沒有差異，但ACS7Δ1-14-Flag

6、蛋白在光下相對(duì)于ACS7FL-Flag更為穩(wěn)定。組成型或誘導(dǎo)過表達(dá)ACS7Δ1-14蛋白會(huì)促使轉(zhuǎn)基因擬南芥產(chǎn)生更強(qiáng)烈的乙烯響應(yīng)表型。利用26S蛋白酶體特異性抑制劑MG132處理可以有效地抑制GVG:ACS7FL-lag轉(zhuǎn)基因擬南芥中ACS7FL-Flag蛋白的降解，但對(duì)GVG:ACS7Δ1-14-Flag轉(zhuǎn)基因擬南芥中ACS7ΔH4-Flag蛋白的積累沒有影響。這些結(jié)果表明N-末端參與介導(dǎo)了ACS7的降解，并且這種降解依賴于泛素/26S

7、蛋白酶體途徑。
　　我們還發(fā)現(xiàn)ACS7 N-末端所介導(dǎo)的蛋白降解受到體內(nèi)發(fā)育和激素信號(hào)以及體外環(huán)境脅迫信號(hào)的調(diào)控。首先，N7(1-54)-GUS和ACS7FL-Flag蛋白在ACS7:N7(1-54)-GUS和GVG:ACS7FL-Flag轉(zhuǎn)基因擬南芥黃化苗中的穩(wěn)定性均高于在光下苗中。對(duì)ACS7:N7(1-4)-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥分析還表明，在光照條件下N7(1-54)-GUS融合蛋白主要在種子萌發(fā)的后期和成苗的衰老葉片中積累水平

8、較高，而在旺盛生長(zhǎng)的幼苗和幼嫩的葉片中幾乎沒有積累。外源乙烯前體ACC處理、高溫、失水和鹽脅迫可以抑制N-末端所介導(dǎo)的蛋白降解，提高ACS7:N7(1-54)-GUS轉(zhuǎn)基因幼苗中N7(1-54)-GUS融合蛋白的水平，黑暗處理則促進(jìn)這一降解過程;另外，生長(zhǎng)素可以特異地促進(jìn)N7(1-54)-GUS融合蛋白在根部的積累。
　　此外，通過將ACS7 N-末端第1-14位氨基酸與實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的一個(gè)葉片衰老的負(fù)調(diào)控因子 SSPP(SENE