斑馬魚Lgfals的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及功能研究.pdf

1、IGFs系統(tǒng)對(duì)發(fā)育、生長和生殖都起著重要的調(diào)控作用。胰島素樣生長因子酸不穩(wěn)定亞基(insulin-like growth factor acid-labile subunit,IGFALs)是IGFs系統(tǒng)中的重要一員,可以與IGFs、IGFBP3/5形成三聚體,延長IGFs半衰期,從而參與對(duì)IGFs的調(diào)控。IGFs系統(tǒng)中的配體和受體以及結(jié)合蛋白都受到高度重視,得到了深入而廣泛的研究,但迄今為止,對(duì)IGFALS的研究僅限于哺乳動(dòng)物出生后生

2、長過程。為闡明IGFALS的功能,我們用斑馬魚作為研究模型,聯(lián)合使用PCR、RT-PCR、熒光定量RT-PCR、RACE、western blot、原位雜交、顯微注射、過表達(dá)、生物軟件分析等技術(shù)和方法對(duì)IGFALS進(jìn)行研究,研究結(jié)果如下。
　　 斑馬魚IGFALs基因位于第3號(hào)染色體上,DNA序列長為3694bp,包括2個(gè)外顯子(長度分別為58bp和3466bp)和1個(gè)內(nèi)含子(170bp)。開放閱讀框位于第二外顯子中,長度為18

3、45bp,編碼20種614個(gè)氨基酸殘基,其中亮氨酸含量達(dá)到20.5％,推測分子量為69127.8Da,等電點(diǎn)為7.65。N-端的前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,成熟肽中含有19個(gè)亮氨酸富集重復(fù)基序(LRR),每個(gè)LRR包括24個(gè)氨基酸殘基,可以用xLxxLxLxxNxLxxLxxxxFxxLx表示,L、N、F分別主要代表Leu、Asn、Phe,各LRR中保守氨基酸的保守程度存在差異。IGFALS氨基酸序列中包含11個(gè)半胱氨酸殘基和5個(gè)天冬酰胺糖

4、基結(jié)合位點(diǎn),與哺乳動(dòng)物分布位點(diǎn)相比,其中10個(gè)Cys分布相同,2個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)分布相同。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、隨機(jī)卷曲,其中α-螺旋最為豐富(占50.98％),β-轉(zhuǎn)角在LRR的分布位置穩(wěn)定。IGFALS三級(jí)結(jié)構(gòu)形似馬蹄,C-端和N-端均向內(nèi)折,彼此靠近,19個(gè)LRR分布不均勻,負(fù)電荷主要分布在C-端和N-端,正電荷主要分布在LRR表面。斑馬魚IGFALS氨基酸序列與其它動(dòng)物差異性很大,與麻雀差異最小(43.9％)

5、,與海鞘的差異最大(85.8％),和哺乳動(dòng)物的差異為48.0-50.8％。在IGFALS系統(tǒng)發(fā)育樹上,斑馬魚和爪檐親緣關(guān)系最近。
　　 克隆得到了GC含量較低的斑馬魚igfals5’端側(cè)翼序列2910bp。和哺乳動(dòng)物不同,序列中具有TATA-box、CAAT-box和GC-box元件,并且均為兩個(gè),這暗示斑馬魚igfals可能能夠轉(zhuǎn)錄兩種mRNA。在該序列的215個(gè)區(qū)域出現(xiàn)了54種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),GH的應(yīng)答元件為GAS2,無G

6、ASl。將不同長度5’側(cè)翼序列連接到pGL3 basic和pEGFP enhancer載體中成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒P1-P7和EP1-7,發(fā)現(xiàn)斑馬魚igfals5’側(cè)翼序列中在-372至-812區(qū)域內(nèi)有啟動(dòng)子活性,在-1623至-2041區(qū)域存在能夠使啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性急劇增強(qiáng)的元件。注射EP1后,從19hpf開始可以在斑馬魚胚胎中觀察到EGFP表達(dá),而且均表達(dá)在體表細(xì)胞上。
　　 斑馬魚igfals mRNA表達(dá)在成魚多種組織器官,在

7、雌雄魚的肝胰臟中表達(dá)最多,腸道、脾臟、腎臟、肌肉、鰓中表達(dá)較強(qiáng),眼睛、腦和心臟中表達(dá)微弱,但在雌雄性腺中的表達(dá)存在差異。雌雄斑馬魚肝胰臟igfals的表達(dá)水平在一個(gè)繁殖周期(7d)內(nèi)的變化趨勢(shì)相同,交配后0d顯著降低,交配后1d急劇升高,從第2天開始沒有顯著差異。雌雄魚肝臟igfbp5 mRNA變化趨勢(shì)相似,igfs mRNA和igfbp3 mRNA變化在雌雄魚之間則幾乎相反,不過同一性別各種igfs mRNA的變化相似,其它基因的變化

8、趨勢(shì)則差異很大。在一天內(nèi),光照條件變化對(duì)處于產(chǎn)卵周期中的斑馬魚雌魚IGFs系統(tǒng)基因的表達(dá)存在顯著影響,但對(duì)非產(chǎn)卵周期的斑馬魚影響不顯著。在6hpf斑馬魚胚胎中可以檢測到微弱的igfals mRNA,之后表達(dá)量上升,24hpf-48hpf表達(dá)量變化不明顯,5dpf時(shí)表達(dá)量大幅度增加。
　　 利用pCS2+MT質(zhì)粒成功構(gòu)建了IGFALS的融合表達(dá)載體pALSMT,過表達(dá)IGFALS之后,斑馬魚胚胎出現(xiàn)了如下表型:眼部輪廓模糊,腦部體

9、積減小,不能形成正常脊索,兩排體節(jié)之間的寬度增加,單個(gè)體節(jié)的寬度減小,脊背神經(jīng)組織扭曲,身體背部加寬,體節(jié)模糊,體節(jié)數(shù)減少,體長顯著變短,但是對(duì)尾芽、近軸中胚層和后腦菱腦節(jié)的發(fā)育沒有顯著影響。IGFALS過表達(dá)明顯增加了igf2a、igf2b、igbp3,gh、ghr的mRNA水平,但對(duì)igflra、igflrb,igfbp5,gh的表達(dá)沒有顯著影響,igf3的表達(dá)水平在10hpf顯著降低,在24hpf顯著升高。過表達(dá)IGFALS之后,

10、JAK2的磷酸化水平顯著升高,AKT的磷酸化程度沒有顯著性變化,表明IGFALs很可能通過JAK2信號(hào)通路影響胚胎發(fā)育。
　　 在一個(gè)產(chǎn)卵周期內(nèi),卵巢igfals的表達(dá)水平在產(chǎn)卵后3-5d顯著升高。igfals在卵巢的濾泡細(xì)胞中表達(dá)。igfals能夠顯著促進(jìn)斑馬魚卵母細(xì)胞的成熟。繁殖周期內(nèi)卵巢igfs和igfbp3/5的表達(dá)變化趨勢(shì)和igfals明顯不同,各種igfs mRNA的變化趨勢(shì)也存在差異。雄性信息素對(duì)igfb和igfb

11、p3的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。處于產(chǎn)卵周期中的斑馬魚卵巢igfals的表達(dá)受光周期影響。DES、DHP、hCG能夠顯著促進(jìn)濾泡細(xì)胞igfals的表達(dá),E2則對(duì)卵巢igfals的表達(dá)沒有顯著影響。igfals和DES、hCG、DHP共作用對(duì)卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn),在一定劑量范圍內(nèi)具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 饑餓顯著增加斑馬魚肝臟igfals和igfbp3的表達(dá),不同饑餓時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響存在差異,恢復(fù)投喂后表達(dá)量先升高后急劇下降至正常水平,但是對(duì)

12、igfl表達(dá)水平的影響則不顯著。腹腔注射GH對(duì)斑馬魚肝臟igfals、igfl、igfbp3表達(dá)水平的影響相似,先顯著抑制表達(dá)水平,之后和對(duì)照組沒有顯著差異。腹腔注射E2后肝胰臟中igfals和igfbp3 mRNA水平的變化趨勢(shì)相同,均為先顯著低于對(duì)照組,后顯著高于對(duì)照組,最后恢復(fù)到正常水平,但對(duì)igfl mRNA水平的影響不同。
　　 斑馬魚IGFALS無論是在基因結(jié)構(gòu)、堿基組成、推導(dǎo)氨基酸的組成以及蛋白質(zhì)空間構(gòu)象,還是在啟

13、動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)都和哺乳動(dòng)物差異較大,另外在GH等刺激作用下,斑馬魚igfals基因表現(xiàn)出和哺乳動(dòng)物不同的變化趨勢(shì),表明igfals基因在斑馬魚中的功能可能和哺乳動(dòng)物存在差異。在斑馬魚igfals啟動(dòng)子序列中存在54種215個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),有很多潛在的調(diào)控因子,并且在很多情況下,igfals和三聚體其它2個(gè)基因的表達(dá)水平完全不同,表明igfals基因在斑馬魚發(fā)育和生命活動(dòng)中的功能可能遠(yuǎn)比目前了解的要復(fù)雜。因此通過對(duì)斑馬魚i