β-catenin調(diào)控小鼠腎臟發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、腎臟是哺乳動(dòng)物滲透調(diào)節(jié)的重要器官，是人體最重要的排泄器官。腎臟同時(shí)還有內(nèi)分泌功能，生成腎素、促紅細(xì)胞生成素、活性維生素D3、前列腺素、激肽等，又為機(jī)體部分內(nèi)分泌激素的降解場(chǎng)所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能，保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進(jìn)行。對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起到重要的作用。哺乳動(dòng)物腎臟有三個(gè)不同的細(xì)胞系來(lái)源:輸尿管芽的上皮細(xì)胞，腎臟胚芽的間充質(zhì)細(xì)胞，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。器官發(fā)生是建立在這些細(xì)胞群之間一連串的形態(tài)互動(dòng)，在

2、分支細(xì)胞和后腎間充質(zhì)細(xì)胞之間的互惠的表皮-間質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換，同型的管間葉原基之間的相互作用，刺激血管的形成是由不同的芽基和間質(zhì)-皮質(zhì)細(xì)胞的相互作用指導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。雖然這些互動(dòng)的生物學(xué)事件是眾所周知的，但分子機(jī)制并沒(méi)有得到很好的規(guī)劃。
　　胚胎腎臟發(fā)育的分子學(xué)基礎(chǔ)哺乳動(dòng)物腎臟發(fā)育起始于輸尿管芽入侵后腎間質(zhì)細(xì)胞?？拷康拈g充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)換成上皮，這是構(gòu)成腎臟的功能性過(guò)濾單位腎元。收集管系統(tǒng)由分支輸尿管起源建立的它的生長(zhǎng)

3、依賴(lài)于后腎間質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)因子，輸尿管和間質(zhì)細(xì)胞的相互誘導(dǎo)在發(fā)育過(guò)程中多次發(fā)生，這也是產(chǎn)生腎臟的總體構(gòu)架的關(guān)鍵步驟。在小鼠身上的基因研究讓研究人員開(kāi)始闡明控制這些早期發(fā)育事件的分子信號(hào)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一系列基礎(chǔ)基因產(chǎn)物構(gòu)成了腎臟發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵。盡管涉及的因素，但遠(yuǎn)未達(dá)到能構(gòu)建一個(gè)完全已知的，粗略的，控制胚胎腎發(fā)展開(kāi)始出現(xiàn)分子級(jí)聯(lián)的框架。我們回顧和總結(jié)這些分子起到的發(fā)育關(guān)鍵作用，特別是特定轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子和它們的受體。
　　Wn

4、t-β-catenin信號(hào)通路是胚胎發(fā)育中最重要的調(diào)控途徑之一，對(duì)多細(xì)胞生物體軸的形成和分化、組織器官建成、組織干細(xì)胞的更新與分化等至關(guān)重要。Wnt信號(hào)通路的異?；罨瘜?dǎo)致或參與多種人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(Alzheimer病)等。研究人員在發(fā)育不全的人類(lèi)腎臟輸尿管核心、基質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中均檢測(cè)到了高表達(dá)的β-catenin。
　　敲除β-catenin基因的第3號(hào)外顯子可使其過(guò)表達(dá)。過(guò)去很多研究主要

5、通過(guò)基因表達(dá)譜分析β-catenin過(guò)表達(dá)對(duì)腎臟發(fā)育產(chǎn)生的影響，而且鑒定了多個(gè)起關(guān)鍵作用的基因。但相關(guān)通路以及相關(guān)通路間的共表達(dá)模式(co-expression pattern)很少被涉及研究到。本文將重點(diǎn)研究分析相關(guān)通路及相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子，深入開(kāi)展β-catenin調(diào)控小鼠腎臟發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。
　　首先是微陣列數(shù)據(jù)的收集和整理。微陣列技術(shù)(Microarray)是近年來(lái)新興的分子生物學(xué)技術(shù)，它對(duì)于人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)現(xiàn)、揭示疾病

6、的本質(zhì)和人類(lèi)探索生命的奧秘有重要意義。DNA微陣列(DNA Microarray)也叫基因芯片(genechip)，是分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展及運(yùn)用和人類(lèi)基因組計(jì)劃(Human GeneomeProject，HGP)的逐步實(shí)施的產(chǎn)物，它是生物學(xué)家受到計(jì)算機(jī)芯片制造和廣為應(yīng)用的啟迪，融微電子學(xué)、生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和光電化學(xué)為一體，在原來(lái)核酸雜交(Northern、Southern)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，它是第三次革命（基因組革命）中

7、的主要技術(shù)之一，是生物芯片中的一種。該技術(shù)的原理是在固體表面上集成已知序列的基因探針，被測(cè)生物細(xì)胞或組織中大量標(biāo)記的核酸序列與上述探針陣列進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)位置雜交探針，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測(cè)。微陣列技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究，可以允許研究者同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)水平，是生物技術(shù)變革的核心。
　　基因芯片產(chǎn)生了大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為功能基因組的研究提供了重要的資源。基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression

8、Omnibus簡(jiǎn)稱(chēng)GEO）是目前最大的而且完全公開(kāi)的高通量分子豐度數(shù)據(jù)庫(kù)，主要儲(chǔ)存基因表達(dá)數(shù)據(jù)。我們?cè)诠矓?shù)據(jù)庫(kù)GEO中檢索和β-catenin第3號(hào)外顯子敲除相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從而研究其過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠腎臟發(fā)育的調(diào)控作用。該數(shù)據(jù)庫(kù)以一個(gè)靈活開(kāi)放的設(shè)計(jì)理念，允許用戶(hù)或科研人員來(lái)遞呈，保存和檢索多種不同類(lèi)型的數(shù)據(jù)。登錄GEO公用數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)址為:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。
　　然后我們利用GSEA

9、提取有效信息。目前在基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域所面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)，就是怎樣在海量基因表達(dá)信息中挖掘到有用信息，并進(jìn)行有效的生物學(xué)專(zhuān)業(yè)解釋分析。這就要用到基因富集分析的方法，基因富集分析的方法有很多，常用的基因富集分析方法可概括為兩大類(lèi)，即bottom-up法和top-down法。本研究用到bottom-up中的GSEA基因集富集分析法?；蚣患治瞿軌蚧蚣椒治霰磉_(dá)數(shù)據(jù)的協(xié)同性差異，從而確定出具體通路。
　　它將芯片表達(dá)數(shù)據(jù)首

10、先進(jìn)行排序，然后與預(yù)先構(gòu)建好的功能基因集進(jìn)行比較，尋找芯片雜交檢測(cè)的這些基因在選定的功能基因集中出現(xiàn)與否以及這些基因在整個(gè)表達(dá)數(shù)據(jù)中的排序位置，分析這些在特定功能基因集中出現(xiàn)的基因是否在某一位置有共同的表達(dá)趨勢(shì)，即富集性質(zhì)。GSEA關(guān)注的不是某幾個(gè)表達(dá)發(fā)生顯著改變的基因，而是整個(gè)雜交數(shù)據(jù)在特定功能基因集中的表達(dá)一致性，以此來(lái)解讀數(shù)據(jù)中蘊(yùn)含的生物學(xué)信息。
　　本研究數(shù)據(jù)選自公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(Gene Expression Omnib

11、us)，研究對(duì)象選取其中和小鼠β-catenin過(guò)表達(dá)腎臟轉(zhuǎn)錄組密切相關(guān)微陣列(microarray)數(shù)據(jù)集，接下來(lái)我們利用GSEA(Gene set enrichment analysis)分析。GSEA是全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析工具，下載后可以免費(fèi)使用。并通過(guò)KEGG進(jìn)行功能注釋?zhuān)┒蓟蚺c基因組百科全書(shū)，KEGG，是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，它整合了基因組學(xué)、生物化學(xué)以及系統(tǒng)功能組學(xué)的信息，有助于研究者把基因及基因表

12、達(dá)信息作為一份整體進(jìn)行研究。
　　利用GSEA分析后的結(jié)果是:我們鑒定出了63條被β-catenin上調(diào)的通路如細(xì)胞周期信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路(Notch signaling pathway)和mTOR信號(hào)通路，以及43條被下調(diào)的通路如Ⅰ型糖尿病信號(hào)通路和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABCtransporters)等通路。經(jīng)KEGG功能注釋?zhuān)@些顯著性通路最終被劃分到了6個(gè)KEGG功能類(lèi)別中。分別是細(xì)胞進(jìn)程(cellular proces

13、ses)功能類(lèi)別，環(huán)境信息處理(environmental information processing)類(lèi)別，遺傳信息處理(genetic informationprocessing)類(lèi)別，人類(lèi)疾病相關(guān)通路類(lèi)別，新陳代謝(metabolism)和有機(jī)系統(tǒng)(organismal systems)類(lèi)別。
　　我們對(duì)其中代表性重要通路中的幾個(gè)有重要相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄因子如PAX2、SREBP1和PPAR_DR1等進(jìn)行分析，對(duì)重要性相關(guān)通路如