食管癌細胞中fascin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制初步研究.pdf

1、陜西師范大學碩士學位論文食管癌細胞中fascin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制初步研究姓名：郭張燕申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：楊章民200705015 、以p B F ．1 4 3 5 為模板進行嵌套缺失試驗，獲得系列缺失子，測序。將測序結(jié)果正確的缺失子和對照質(zhì)粒p G L B 、內(nèi)參照質(zhì)粒p R L T K 一同瞬時轉(zhuǎn)染E C l 0 9 細胞，培養(yǎng)4 8 - ' J 、時后裂解細胞進行雙熒光素酶報告基因檢測。6

2、、生物信息學預測轉(zhuǎn)錄起始位點上游3 8 7 b p 區(qū)段內(nèi)存在哪些潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。7 、以p B F ．3 8 7 為模板，用P C R 及酶切的方法構建元件( S P l 、C R E B 、T A T Ab o x ) 缺失表達載體，測序。8 、以空載體p G L B 為對照，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒p R L - T K一同瞬時轉(zhuǎn)染E C l 0 9 細胞，培養(yǎng)4 8 小時后裂解細胞進行雙熒光素酶報告基因檢測，結(jié)果

3、分析。結(jié)果和結(jié)論：1 、以食管癌細胞系E C l 0 9 全基因組D N A 為模板，成功擴增出f a s c i n 基因5 ’側(cè)翼區(qū)3 k b 片段，測序結(jié)果與G e n B a n k q b 注冊的J k f a s c i n 基因# 圣．N C B I ／B L A S T 比對，證明確為f a s c i n 基因，除四個堿基不同外，相似度達到9 9 ．9 ％。2 、以p T F - 2 9 0 0 為模板P C R 分段

4、擴增f a s c i n 基因5 ’側(cè)翼區(qū)依次截短約5 0 0 b p 的四條片斷，測序結(jié)果經(jīng)N C B I ／B L A S T ，證明擴增結(jié)果正確，與預期擴增長度吻合。3 、成功構建螢火蟲熒光素酶報告基因表達載體p B F ．2 9 0 0 - - 4 3 6 。4 、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢澳1 ] p B F ．2 9 0 0 - 4 3 6 在E C l 0 9 細胞中啟動熒光素酶表達活性，結(jié)果表B 羽f a s c i

5、 n 基因在E C l 0 9 細胞中確有顯著的啟動子活性，且啟動子區(qū)至少位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游4 3 6 b p 內(nèi)。5 、通過嵌套缺失所得缺失子測序，表明成功獲取系列缺失子質(zhì)粒p B F ·1 4 3 5 - + 8 2 。6 、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測系列缺失子在E C l 0 9 細胞中啟動熒光素酶表達活性，結(jié)果分析確定f a s c i n 基因核心啟動子區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游3 1 6 b p到2 2 b p

6、的區(qū)段內(nèi)。7 、應用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫軟件A l i B a b a 2 ．1 分析預$ Y f a s c i n 5 ’側(cè)翼．3 8 7 區(qū)段內(nèi)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，總共發(fā)現(xiàn)5 6 個轉(zhuǎn)錄因子，其中包含多個S P l 結(jié)合位點，在靠近T A T A 框處存在一段D N A 序列，可同時結(jié)合C R E B 、C ／E B P a l p h a 、A T F 、C R E -B P l 、e - J u n 等多個轉(zhuǎn)錄因子。8 、成功構